专利名称：人鼠嵌合型抗人CD14抗体Hm2F9及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，主要涉及人鼠嵌合型抗人CD14抗体Hm2F9及在制备抗内毒素治疗药物中的用途。
背景技术：
CD14 分子是一种糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)的锚定蛋白，分子量约^KDa左右，主要在单核细胞和巨噬细胞上表达。⑶14在体内有两种存在形式膜 CD14 (membrane CD14, mCD14)和可溶性 CD14 (soluble CD14, sCD14)。CD14 是重要的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)识别受体，G_菌进入血液后，细菌脂多糖结合蛋白(lipopolysacchride binding protein，LBP)、LPS 与单核 / 巨噬细胞表面的 mCD14 分子形成复合物，触发Toll-like受体4 (TLR4)信号传导通路，信号传递给细胞内的接头蛋白MyD88，激活特异性转录因子如核因子-κ B (nuclear factor-kappa B, NF-κ B )、活化蛋白-1 (activator protein-l，AP_l)禾口干扰素调节因子一3 (interferon regulatory factor-3, IRF-3)，介导单核巨噬细胞分泌炎症前因子和某些中间体以及共刺激因子的表达。s⑶14可代替mCD14与LPS形成复合物，使不表达mCD14的上皮细胞和内皮细胞对LPS 的敏感性增加，引起粘附分子的表达增高和靶细胞的损伤，从而加重炎症反应。另外除了 TLR-4信号通路外，CD14 可以识别G+菌的肽多糖(ρ印tidoglycan)成分，激活TLR-2 受体介导特异性的炎症反应。这些反应在局部感染中可以起到消灭病原微生物的作用，但是同样可能引发严重的败血症或感染性休克。由于CD14在LPS的致炎过程中的起着关键作用，如何对其进行人为的调控，已成为抗内毒素治疗研究的重要领域之一。有研究发现mCD14阴性细胞转染CD14基因后可使其对LPS的反应增强1000倍，而⑶14基因敲除小鼠对LPS的敏感性较对照组下降10000 倍，源于CD14基因敲除小鼠的单核细胞对LPS的敏感性降低。因此在发生败血症或感染性休克时，阻断CD14的功能，抑制其引发的对病原微生物的固有免疫反应。目前，已有一些 CD14特异性的单克隆抗体在体外实验、动物实验和临床试验中显示了较为理想的效果。动物试验发现，CD14单抗对低浓度LPS的阻断效应非常明显，可以降低内毒素血症兔子的死亡率，减少肾脏坏死和肺损伤，而且无论是预防性的给药以及感染后治疗性的给药均有保护作用，但是由于抑制了机体免疫系统对病原微生物的反应，可能增加二次感染的几率。在内毒素血症短尾猴的动物实验中，28C5 (—种抗人CD14特异性的鼠源性单抗)也取得了类似的结果，预防性的用药降低了低血压、肺渗出的发生率，减少了前炎症因子的释放。IC4 U8C5的人鼠嵌合型工程抗体)已进入到临床试验阶段，在健康人群和严重败血症患者中应用显示其具有较好的耐受性和较低的免疫原性，健康人群预防用药可以减轻LPS引发的临床症状，抑制前炎症因子的释放，但在严重败血症患者的治疗中不能降低患者的死亡率，也不能抑制前炎症因子的释放，不过可以在一定程度上减轻患者多脏器功能的损伤。虽然，目前CD14特异性的单克隆抗体的抗内毒素治疗已经取得一些效果，但是疗效有限，副作用较多，且不同单抗的抗原表位不同，其临床效果也有差异，故有必要对更多的CD14单克隆单体进行基因工程的改造。ZCH(Zhejiang Children's Hospital)-7-2F9 (简称 2F9)为鼠抗人 CD14 单抗，属鼠IgGlK亚类，它已被第6届国际人类白细胞分化抗原命名大会(HLDA6)正式命名，是我国唯一为IgGlK亚类的CD14单抗。但是该抗体是鼠源性的，在临床治疗中可能发生血清病或产生人抗鼠免疫球蛋白抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)，只有将其进行人源化的改造，将抗体分子中部分鼠源片段替换为人源片段，以大大降低或基本消除抗体的免疫原性。
发明内容
本发明目的是提供一种人鼠嵌合型抗人⑶14抗体Hm2F9，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。所述的抗⑶14的人鼠嵌合型的抗体Hm2F9 是鼠源性单克隆抗体ZCH-7-2F9的单链抗体(参见文献Ning BT, Tang YM, Cao J, Shen HQ, Qian BQ. [Construction and expression of prokaryotic vector of single chain antibody derived from a new clone of anti_CD14 antibody ZCH-7-2F9]· Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2008. 37(1) : 51-9.)和人 IgG 的 Fc 片段融合蛋白。本发明的另一个目的是提供所述的一种人鼠嵌合型抗人CD14抗体Hm2F9在制备抗内毒素血症药物中的应用。研究表明，所述的人鼠嵌合型抗人CD14抗体Hm2F9具有特异性结合CD14阳性细胞的能力。⑶14分子是LPS结合蛋白，主要在单核细胞和巨噬细胞上表达，与LPS和LBP结合成复合物后，可以通过Toll-like受体4信号传导通路，介导单核巨噬细胞分泌炎症前因子和某些中间体以及共刺激因子的表达。阻断CD14的功能，可以抑制其引发的对病原微生物的固有免疫反应。ZCH-7-2F9单抗具有良好的识别CD14抗原而不识别其他组织、细胞成分的特性，因此，该抗体具有制备治疗内毒素血症药物的应用前景。但2F9是鼠源性的抗体，应用于人体会产生免疫反应其根本原因是鼠源性免疫球蛋白(抗体)的Fc段对人体具有免疫原性，因此，有必要对鼠源性抗体进行人源化改造。本发明研制的嵌合抗体Hm2F9，是通过一系列繁琐而复杂的分子生物学技术构建带有SCFv2F9-FC基因的分泌型真核表达载体，然后转染哺乳动物细胞CHO获得的。该抗体对CD14阳性的细胞具有特异性的识别能力，对临床内毒素血症的治疗将产生十分重要的应用价值。
图1是Lk _scFv2F9理论序列。图2是scFv2F9片段PCR产物电泳图。图3是TA- scFv2F9 EcoR I酶切鉴定电泳图。图4是TA-ScFv2F9质粒测序结果。图5是pHMCH3-Hm2F9质粒酶切鉴定电泳图。图6是G418筛选第10天未转染组CHO细胞组及转染组细胞图。图 7 是 CH0-Hm2F9 细胞 RT-PCR 结果。图8是CH0-HmF9细胞培养上清流式分析图。
图 9 是 HmF9 SDS-PAGE 图。图 10 是 HmF9Western-Blot 图。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一分泌型人鼠嵌合真核表达载体pHMCH3-Hm2F9的构建第一部分重组载体pHMCH3-Hm2F9的构建
1.以本实验室前期构建的带有鼠抗人CD14单克隆抗体2F9单链的Psectag 2Ascfv2F9载体(参见文献Ning BT, Tang YM, Cao J, Shen HQ, Qian BQ. [Construction and expression of prokaryotic vector of single chain antibody derived from a new clone of anti-CD14 antibody ZCH-7-2F9]· Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2008. 37(1): 51-9.)为模板，设计引物，PCR扩增出scFv2F9片段(序列参见图1 )，并将Sfi I和EcoR I酶切位点引入该片段的两端(参见图1中两端划线部分)。1. 1设计引物通过PCR将酶切位点Sfi I和EcoR I (划线部分)弓丨入scFv2F9 的两端，引物序列如下
scFv2F9 段上游引物(SEQ ID NO 3) 5 ‘ -GGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGCA -3 scFv2F9 段下游引物(SEQ ID NO 4) 5' - GAATTCTTTTATTTCCAACTTGG -3' 1.2PCR反应体系
权利要求
1.一种人鼠嵌合型抗人⑶14抗体Hm2F9，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
2.根据权利要求1所述的一种人鼠嵌合型抗CD14抗体Hm2F9在制备抗内毒素治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种人鼠嵌合型抗CD14抗体Hm2F9，是鼠源性CD14特异性单克隆抗体ZCH-7-2F9的单链抗体和人IgG的Fc片段结合的嵌合抗体。由于CD14分子在LPS的致炎过程中的起着关键作用，对其进行人为的调控，已成为抗内毒素治疗研究的重要领域之一。本发明提供的单抗具有良好的特异性结合CD14阳性细胞而不识别其他组织、细胞成分的特性，可在制备抗内毒素血症药物中的应用。
文档编号A61P7/00GK102260350SQ20111019134
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月9日 优先权日2011年7月9日
发明者宁铂涛, 汤永民, 沈笛颖 申请人:浙江大学