专利名称：鳜传染性脾肾坏死病毒(isknv)orf093蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093 蛋白的应用。
背景技术：
鳜LSinipercei chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一，由传染性脾肾
Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)弓白勺病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致鳜死亡率接近100%，成为制约鳜养殖业发展的主要瓶颈。 长期以来，对于鳜病毒病的防治一直没有有效的药物，而且抗生素、化药等防治疾病弊端众多，如病原耐药性、环境污染、食品安全问题等。因此作为符合环境友好和可持续发展战略的病害控制措施，疫苗、抗血清等生物制剂正成为国际现代水产养殖业的标准生产规范和研究开发的前沿热点领域。因此，研制与发展鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗及治疗制剂对防治鳜鱼虹彩病毒病具有战略意义，寻找新的疫苗候选抗原及抗病毒血清是当今鳜鱼虹彩病毒病研究的重点之一。传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)是虹彩病毒科肿大细胞属的代表种，为细胞质内寄生的具囊膜二十面体病毒，直径为150nm，含有双链DNA，基因组由111，362个碱基组成，包括125个预测开放读码框ORF (open reading frames)，鳜鱼是其主要感染宿主。目前控制病毒性疾病主要有两种手段接种疫苗和使用抗病毒药物。在鳜虹彩病毒病疫苗研究方面，潘厚军等采用灭活组织浆疫苗对其进行防治，在室内和田间实验效果较好，但是由于疫苗材料来源于病鳜内脏组织，受季节和数量上的限制，推广应用有一定的困难。由于基因工程疫苗不受上述条件的限制，成为研制鳜ISKNV疫苗的一个理想的方法。2004年，张敏等进行了 ISKNV主衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP)的原核表达，采用免疫印记的方法初步确定了重组MCP蛋白与ISKNV MCP蛋白有相同的抗原特性，为ISKNV重组亚单位疫苗的研制提供了思路。2009年，付小哲等对重组MCP蛋白的免疫原性进行了初步研究，发现重组 MCP蛋白有较好的免疫原性，可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答。在其他虹彩病毒病疫苗研制方面，日本的研究人员研制出抗真鲷虹彩病毒(RSIV)细胞灭活疫苗，免疫保护率在75%以上，是亚洲地区唯一成功进行商业化生产和应用鱼类病毒性疾病的疫苗。日本研究人员还对RSIV核酸疫苗(0RF380R，ORF 569R)进行了研究，结果显示重组核酸疫苗能够产生45 60%左右的免疫保护。Park等根据0RF055构建了条石鲷虹彩病毒(RBIV)核酸疫苗，结果显示免疫真鲷血清在BF-2细胞上对病毒具有一定的中和作用，但尚无免疫保护数据。在抗血清等抗病毒药物方面尚无相关研究。到目前为止，还没有出现以ISKNV 0RF093基因作为疫苗前体及其抗血清制剂的研究报道。
发明内容
本发明提供了鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗及药物中的应用。本发明所采用的技术方案如下
鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。优选的，所述(ISKNV) 0RF093蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明具有以下有益效果
鳜ISKNV 0RF093蛋白对鳜虹彩病毒病有较好的免疫预防作用，由0RF093重组蛋白制备的抗血清对鳜虹彩病毒病也有较好的中和效果。制备的0RF093重组核酸疫苗免疫鳜鱼 30天后，保护率超过45%，由0RF093重组蛋白制备的兔抗血清对ISKNV也有较强的中和作用，中和液注射鳜鱼观天后，相对存活率超过56%。因此，鳜ISKNV 0RF093蛋白可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗或新药物。
图 1 是 ISKNV 0RF093 基因的 PCR 扩增图，其中 M 为 maker，1 为 ISKNV 0RF093 基因；
图2是SDS-PAGE分析ISKNV 0RF093重组融合蛋白的表达图，其中1为蛋白marker， 2为pET3h(+)空载，3为诱导表达上清，4为诱导表达前菌体，5、6为诱导表达后菌体总蛋白；
图3是SDS-PAGE分析ISKNV 0RF093重组融合蛋白的纯化图，其中1为蛋白marker，2 为pET32a(+)空载，3为纯化后的重组蛋白，4为表达重组蛋白包涵体；
图4是重组质粒pET3h-093表达产物的western- bloting分析图，其中1为 pET32a(+)空载，2为0RF093重组蛋白，3为预染蛋白marker ；
图5是免疫斑点检测ISKNV图，其中1为鳜脑细胞，2为细胞培养的ISKNV。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例1
1鳜ISKNV 0RF093重组蛋白在大肠杆菌中的原核表达
1.1根据GenBank中传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) [NC_003494] 0RF093序列(SEQ ID NO: 1)设计引物，并引入酶切位点(以下划线标注)。引物序列如下
Pl [5~- CGGAATTCATGAATAAAACGC -3，(SEQ ID NO :3)，引入 EcoR I 酶切位点； P2 [5' - CGGAAGCTTTTAAACATGGCGTC -3，(SEQ ID NO :4)，引入 Hind III酶切位点。1.2以本实验室自保存的鳜ISKNV基因组为模板进行PCR扩增，25 μ L PCR反应体系包含10 Xbuffer (含 Mg2+)2. 5 μ L，4X dNTP (10mmol/L)0. 5 μ L，上下游引物(20 μ mol/ L)各 0.5 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0. 3 μ L，DNA 1. 0 μ L，无菌双蒸水补足。PCR 反应条件94°C预变性4min ；94°C变性45S，50°C复性45S，72°C延伸30S，30个循环；72°C延伸 IOmin0 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果显示，在900bp左右出现亮带，片段大小与预期927bp基本相符(见图1 )，将目的产物进行胶回收纯化，送至测序公司测序，序列见 SEQ ID N0:1。1.3将纯化后的ISKNV 0RF093 PCR产物及提取的原核表达质粒pET3h ( + )，分别用Hind III和EcoR I进行双酶切。ρΕΤ3^ι ( + )的酶切体系为10XNEB Buffer 5 μ L， 100 X BSA 0. 5μ L, EcoR I (20U/y L) 1 μ L, Hind III(20U/y L) 1 μ L, pET32a ( + ) 15 μ L (7μ g/μ L)，灭菌双蒸水补足50μ L。0RF093 PCR产物酶切体系为10XNEB Buffer 5 μ L， 100XBSA 0. 5 μ LjEcoR I (20U/μ L)1 μ L，Hind III(20U/μ L)1 μ L，0RF09340 μ L (2. 5μ g/ μ L)，灭菌双蒸水补足50 μ L0将酶切产物进行胶回收纯化。1.4将纯化后的PCR产物和pET3h( + )质粒16°C连接过夜，连接体系为 pET32a( + ) (9ng/ μ L) 3. 0 μ L, 0RF093 5· 0 μ L (7ng/μ L)，Τ4 DNA ligase (5U/ μ L) 1. 0 μ L, 2 X Rapid Ligation Buffer 1.0 μ L01.5将连接反应液5 μ L加入IOOyL DH5 α感受态细胞(Takara，Japan)中，轻轻旋转离心管以混勻，置冰浴30min后，将感受态细胞置于42°C水浴热激90S，然后快速转到冰浴中冷却:3min。再向每个离心管中加入900 μ L灭菌的LB培养基，混勻后置于37°C摇床振荡培养45min (转速200rpm/min)。吸取100 μ L已转化的感受态细胞涂布LB平板(含 amp 50μ g/mL)，37°C正置培养30min后，倒置培养16h。1. 6挑取白色菌落，接种于3mL加Amp (终浓度50 μ g/mL)的LB液体培养基中， 370C 200rpm培养过夜。吸取ImL菌液转入1. 5mL离心管中，送至测序公司测序，鉴定重组表达载体pET3^i-0RF093是否正确构建，序列见SEQ ID N0:1。1. 7吸取含有鉴定正确的pET3h-0RF093 DH5 α菌液30 μ L加到3 mL含有Amp (终浓度50μ g/mL)的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养过夜。采用质粒提取试剂盒 (OMEGA, USA)提取重组质粒pET32a-0RF093o取2 μ L重组质粒加入100 μ L BL21 (DE3)感受态细胞(Takara，Japan)中进行转化，后续实验方法见步骤1. 5。1.8挑取白色菌落，接种于3ml加Amp (终浓度50 μ g/ mL)LB培养基中，37°C震荡过夜，按1%的接种量再次接种于含有Amp培养基中继续培养至OD值为0. 6，加入IPTG (终浓度为lmmol/L)，37°C诱导表达4h。1. 9收集菌体进行SDS-PAGE分析。配制15%的分离胶和5%的浓缩胶。吸取20 μ 1 菌液，加入等体积2 X SDS-PAGE上样缓冲液，混勻后100°C水浴5min，吸取20 μ 1样品加入点样孔中，120V电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳，将凝胶置于新配的考马斯亮蓝染色液中，染色lh，回收考马斯亮蓝染色液，加入脱色液室温下摇动脱色，直至背景颜色完全脱去。结果显示在约36KD处有一条特异性表达带，与预期大小相符(见图2)，其氨基酸序列见SEQ ID NO :2ο1. 10 融合蛋白按照 Bugbuster His Bind Purfification KitCNOVAGEN, Canada) 说明书进行纯化。1. 11将纯化好的蛋白溶液装入透析袋，4°C依次用透析液1、2、3、4、5进行透析， 透析时间依次为21^^31:31^1 (过夜)。再将透析好的蛋白溶液用PEG20000进行浓缩。 吸出透析好的样品溶液，12000rpm离心IOmin，取10 μ 1上清进行SDS-PAGE分析(见图3)， 方法见步骤1.9。透析液1 :50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5)，4 mM Urea , 5mM EDTA,5πιΜβ-巯基乙醇，20%甘油；
透析液 2:50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5)，2 mM Urea ,2. 5mM EDTA, 2. 5mMB-巯基乙醇，20%甘油；
透析液 3 :50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5), 1 mM Urea, ImM EDTA, ΙπιΜβ-巯基乙醇，20%甘油；
透析液 4 50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5) ,0. 5 mM Urea, 5mM EDTA,
0. 5mMB-巯基乙醇，20%甘油；
透析液 5:50 mM Tris-Cl (pH8. 5)，20% 甘油。2抗重组0RF093融合蛋白多克隆抗体的制备
2.1将复性后的0RF093重组蛋白浓度调整为ang/mL，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化。2. 2取新西兰白兔2只，一只注射0RF093重组蛋白，一只注射PBS(pH7. 4)。注射前，从耳静脉取Iml血制备血清，作为对照。2. 3首次免疫采用皮下多点注射方式进行，每只注射anl。免疫15天后进行加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量为初次免疫的2/3。以后每隔7天加强免疫一次，免疫剂量为初次免疫的2/3。每次加强免疫前均由耳静脉取血1ml，ELISA检测抗体效价。2. 4待效价达到所需效价时，割断兔颈动脉放血。50mL离心管收集全血，室温静置 lh，待其凝固后，放置4°C冰箱过夜。4°C下5000rmp离心lOmin，取上清即血清。在血清中加入0. 05%叠氮钠，小管分装后-20°C保存。3免疫印记分析抗重组0RF093融合蛋白多克隆抗体
3.1将纯化后的重组0RF093融合蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，方法见步骤1. 9。3. 2电泳完毕后，将凝胶上分离的蛋白转移到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，在80mA 的电流下转移4h，丽春红染色观察转移情况。3. 3用含5%的脱脂奶粉的封闭液封闭无关蛋白的潜在结合位点，室温摇床孵育 lh。3.4弃封闭液，立即加入抗重组0RF093融合蛋白多克隆抗体和新的封闭液 (1:100)，4°C孵育 lh。3. 5转移掉封闭液，用PBS漂洗3次，IOmin/次。最后用TBS漂洗1次，lOmin。3.6取2 μ L辣根酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)稀释于IOmL溶解液中(5%脱脂奶粉，50mM Tris-Cl, pH7. 5,150mM NaCl) (1 5000)，将膜浸泡于此液中，排除袋里气泡，然后密闭袋口，摇床上轻摇，37 °C Ih。3. 7去掉辣根过氧化物酶溶液，TBS漂洗3次，IOmin/次。漂洗后的膜移入干净培养皿，按膜面积加入0. lmL/cm2的底物溶液(DAB)与H2A混合液(IOmL底物溶液加入IOyL 30% 液，混勻后立即使用)。3. 8室温轻摇，仔细观察蛋白带的生色反应，一旦蛋白带的颜色深度达到要求(约 2-3min),即用水稍为漂洗，将滤膜转移到装PBS的培养皿中，终止反应。结果显示，抗血清能与重组蛋白发生反应，并显示出一条相应大小的蛋白条带(见图4)。4.免疫斑点分析抗重组0RF093融合蛋白多克隆抗体4.1将鳜脑细胞传瓶至25cm2的细胞培养瓶，待细胞形成汇合的单层后，吸出培养瓶中的培养基，然后加入约Iml的ISKNV病毒滤液，27°C约Ih进行病毒吸附。吸出感染上清，加入细胞维持液(L-15添加5%的FBS)，置27°C细胞培养箱培养5天。4. 2将ISKNV的细胞培养物，反复冻溶3次后，40000rpm/min离心，沉淀用TE缓冲液溶解，未感染的鳜脑细胞也经同样处理。4. 3将5 μ L溶解的沉淀点在硝酸纤维素滤膜上，设鳜脑细胞做阴性对照。60°C烘干lh，用含5%的脱脂奶粉的封闭液封闭，室温摇床孵育lh。以后操作均与免疫印迹分析相同，方法见步骤3. 5 3. 8。结果显示，ISKNV的细胞样品处有明显的斑点出现，而鳜脑细胞对照则没有斑点(见图5)，说明重组0RF093抗血清可以和ISKNV反应，重组0RF093有与ISKNV 0RF093相似的抗原特性。5.鳜ISKNV与抗重组0RF093融合蛋白多克隆抗体中和试验
5.1实验鳜鱼(购自广东省佛山市荷塘镇三根养殖场)，体质量40-50g，在充气及流水养殖池内暂养2周。从中随机挑取20尾，经镜检观察寄生虫、肝脏分离细菌、PCR检测ISKNV 全部阴性，确认健康后用于实验。实验期间水温27 31°C，每天投喂饵料鱼(鲮鱼)，攻毒后改为每隔3天投喂一次饵料鱼。5. 2取具有典型鳜病毒病症状的鳜鱼脾和头肾，经PCR检测为ISKNV阳性后，以1 10质量体积比加PBS冰浴勻浆，40C 4 000r/min离心30min，取上清经0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，加入青霉素和链霉素至1000 UI/ml，4°C冰箱中保存。取病毒滤液接种于胰蛋白胨琼脂培养基上，培养温度为30°C，4 后，观察培养基上无细菌生长，此病毒滤液用于中和试验。5. 3将实验鳜鱼随机分为3个实验组，分别为093组、阳性对照组、阴性对照组，每组30尾，每个组设一个平行对照组。将制备好的兔抗重组0RF093融合蛋白血清与病毒滤液按1 :1比例混合，4°C放置过夜(12小时左右)，次日腹腔注射093组鱼体；阳性对照组腹腔注射病毒滤液；阴性对照组腹腔注射PBS(pH7.4)。各组的注射体积均为200 μ L/尾。观察28天，每天记录发病情况。结果显示(见表1)，观天后，093组、阳性对照组、阴性对照组各组的平均累积死亡率分别为43. 3%、100%、0，093组的相对保护率为56. 7%，说明制备的抗重组0RF093融合蛋白多克隆抗体对ISKNV具有较好的中和效果，可以用来制备防治鳜虹彩病毒病的药物制剂。
权利要求
1.鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。本发明的鳜ISKNVORF093蛋白对鳜虹彩病毒病有较好的免疫预防作用，保护率超过45%，可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗或新药物。
文档编号A61K39/12GK102240399SQ201110191339
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月9日 优先权日2011年7月9日
发明者付小哲, 吴淑勤, 李宁求, 潘厚军, 石存斌 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所