一种基于氢核磁共振快速测定维格列汀纯度的方法与流程

本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种基于氢核磁共振快速测定维格列汀纯度的方法。

背景技术：

目前糖尿病是严重威胁人类健康的疾病，国际糖尿病联盟预测至2030年该病的患者将有5.52亿。目前二肽基肽酶(DPP-4)抑制剂是治疗糖尿病的热门药物，具有葡萄糖依赖性的刺激胰岛素分泌作用，在控制血糖过程中不易引起低血糖的发生，此外，还具有恢复胰岛β细胞功能的作用。维格列汀以其独特的结构优势和应用前景为Ⅱ型糖尿病的治疗提供了新的选择。

如图1所示，维格列汀分子中无共轭结构，在近紫外区无吸收，同时在其合成过程中往往含有少量的在近紫外区无吸收的杂质，如1,3-二环己基脲。该化合物不适合常规的HPLC-UV分析，因当采用传统的HPLC-UV方法测定其纯度，紫外检测波长只能选择末端吸收，从而造成了仪器噪音高，选择性差等缺点。同时HPLC-UV方法对样品中存在的溶剂残留(水、乙醇等)，无法一次性测定，仍需结合气相色谱等方法扣除溶剂残留量，才能最终获得维格列汀真实的纯度。因此，常规的HPLC-UV方法不能很好的满足维格列汀纯度分析的需要。药品纯度检测方法的研究是医药研发中一项重要内容，药品制剂原料的纯度最终影响成药的用药安全和疗效。因此，需要研究一种能对维格列汀纯度进行简便、快速、准确测定的分析方法。

氢核磁共振法因其具有的高灵敏度、高精确度、分析快速等优点已被广泛应用于有机化合物的结构解析和定性分析中，但是由于维格列汀中含有的金刚烷基、吡咯烷基、仲胺基、羟基、酮基及腈基相互作用对维格列汀质子共振峰影响较大从而难以通过氢核磁共振对维格列汀进行定量分析。

技术实现要素：

为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于氢核磁共振快速测定维格列汀纯度的方法，能够准确、稳定、快速的测定维格列汀纯度。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于氢核磁共振快速测定维格列汀纯度的方法，测定维格列汀样品及内标物的定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(T₁)，通过比较获得最大纵向弛豫时间(T_1max)，根据T_1max设定核磁共振波谱仪的脉冲倾倒角和弛豫延迟时间(d₁)，再用所述核磁共振波谱仪测定维格列汀样品中的纯维格列汀相对于内标物的摩尔比，然后根据内标物的质量，计算维格列汀样品中的纯维格列汀的质量，进而计算出维格列汀样品纯度，其中，所述脉冲倾倒角为30°～90°，所述弛豫延迟时间大于等于2.3～5倍的最大纵向弛豫时间，所述维格列汀样品的定量目标峰的化学位移(δ_H)为4.78。

脉冲倾倒角和弛豫延迟时间是建立氢核磁共振定量方法过程中两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，目前也有研究他们与检测结果关系的文献报道，在实际测定纯度时有一个公认测定步骤：将内标物与待测物质溶解于溶剂中，进行仪器参数设定的测量，在进行参数的测定时将脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等同于共振频率等参数进行设定，导致方法准确性存在盲目性。本发明的发明人在研究中克服了技术偏见，本发明测定了维格列汀样品及内标物的定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(T₁)，并确定了在脉冲倾倒角为30°～90°时的弛豫延迟时间，使检测的维格列汀样品纯度更准确。

核磁共振定量的原理是含氢有机化合物NMR波普信号直接与原子数目成正比，因此在实验参数设定时，需要被测物和内标物上的共振峰与其对应的原子数尽可能保持一致，若选择不合适位置的氢进行纯度的测定，会受溶剂中杂质以及溶剂本身等干扰峰的影响较大，被测组分和杂质信号之间存在干扰，被测组分和内标也会出现信号重叠，导致积分不准确，检测结果重现性差。维格列汀中仲胺基和羟基的质子为活泼H，其信号不稳定，不易作为目标峰，金刚烷基和吡咯烷基上仍有许多可以检测的质子，每个质子的共振峰都会对应不同的倾倒角和弛豫延迟时间等参数，所以选择哪个位置的氢进行纯度测定是目前限制利用氢核磁共振测定维格列汀纯度的技术难题之一。金刚烷基的质子化学位移在1-2ppm，其共振峰干扰多、两侧基线不平、重现性较差，以金刚烷基质子的共振峰作为目标峰，难以确定金刚烷基质子具体对应哪个化学位移的共振峰，也难以对具体共振峰进行积分计算，导致检测结果的准确性低，检测速度减慢；虽然吡咯烷基的质子化学位移在2-5ppm，得出的共振峰更适宜检测，但是由于同一位置(如-CH₂-)的两个质子的化学位移不一定相同，因而氢谱中某化学位移对应的共振峰并非对应某一位置的所有质子。本发明中化学位移4.78ppm处的共振峰干扰小、两侧基线较平、重现性较好，4.78ppm处的共振峰可以唯一确定为与腈基相连的碳上的质子的共振峰，选择化学位移(δ_H)为4.78ppm的共振峰为定量目标峰，检测结果准确性更高、计算更为简便、检测速度更快。

优选的，测定维格列汀样品中的纯维格列汀相对于内标物的摩尔比的具体步骤为：将一定量的维格列汀样品及内标物溶解于氘代试剂中，并转移到核磁管中，测定维格列汀及内标物中各定量目标峰的积分面积(对每一信号6次积分取平均值)，得出维格列汀相对于内标物的摩尔比。

优选的，所述核磁共振波谱仪的检测参数为：共振频率为400MHz，谱宽20ppm，测试温度23℃，弛豫延迟时间(d₁)为6～100s；采样时间(AQ)为2.0～4.1s；采样累加次数为16～32次。核磁共振仪需要液氮维持超导磁体产生的强磁场从而保证核磁共振仪的正常运行，测试时通常采用较低温度以减少液氮的消耗，从而保证核磁共振仪的长时间运行；维格列汀中含有仲胺基和羟基，容易产生分子间氢键，会降低核磁共振图谱的分辨率，从而降低了检测的准确性，在保证较少液氮消耗的前提下，适当升高温度能够破坏仲胺基和羟基处氢键的形成，使其质子峰谱向高场移动，降低了其化学位移值，从而提高分辨率，选择23℃的进行测试，即保证了较少的消耗液氮，保证核磁共振仪的长时间运行，又提高了核磁共振图谱的分辨率，增加了检测维格列汀纯度的准确性。

优选的，维格列汀的检测浓度为13-15mg/mL。核磁共振检测样品的浓度一般为20mg/mL左右，由于维格列汀中含有能够产生氢键的仲胺基和羟基，降低维格列汀的检测浓度能够破坏仲胺基和羟基处氢键的形成，而维格列汀的检测浓度降低到一定程度，核磁共振仪会因为共振信号较弱，从而进一步降低检测维格列汀纯度的准确性，选择维格列汀的检测浓度为13-15mg/mL，既保证了核磁共振仪能够准确检测共振信号，又能破坏仲胺基和羟基处氢键的形成，从而进一步提高了检测维格列汀纯度的准确性。

进一步优选的，当所述脉冲倾倒角为30°时，所述弛豫延迟时间大于等于2.3倍的最大纵向弛豫时间；当所述脉冲倾倒角为90°时，所述弛豫延迟时间大于等于5倍的最大纵向弛豫时间。能够进一步保证检测维格列汀纯度的准确性。

优选的，所述氘代试剂为重水、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)。

进一步优选的，所述氘代试剂为DMSO-d₆。

优选的，所述内标物为室温条件下不与维格列汀发生化学反应的化合物。

进一步优选的，所述化合物的质子化学位移(δ_H)在16.00～6.01或δ_H 6.01～4.78或δ_H 4.57～3.66或δ_H 3.44～2.51或δ_H 1.43～0.00范围。避免维格列汀氢共振峰与内标的氢共振峰之间重叠

更进一步优选的，所述内标物为顺丁烯二酸。目前可用于作为内标物的物质有苯、苯甲酸苄酯、马来酸、N,N-2甲基甲酰胺、过氧化苯甲酰、非那西汀、2,4-二硝基甲苯、三氟乙酸钠、DMSO-d₅、邻苯二甲酸氢钾、磷酸等，每种内标物都有至少一种氢共振峰，待测物质维格列汀的选择哪个位置的质子作为检测的对象也是不确定的，所以选择哪种内标物，哪种氢共振峰都是没有任何依据的，这也是目前限制利用氢核磁共振测定维格列汀纯度的技术难题之一。

优选的，计算出维格列汀样品纯度的公式为：

W％＝(m_IS×H_IS×A_S×M_S×100％)/(M_IS×A_IS×H_S×m_S)

W％—维格列汀的纯度；

m_IS—内标物的真实质量(内标物的质量×纯度)，mg；

H_IS—内标物定量目标峰的质子数；

A_S—维格列汀定量目标峰的积分值；

M_S—维格列汀的摩尔质量，g/mol；

M_IS—内标物的摩尔质量，g/mol；

A_IS—内标物定量目标峰的积分值；

H_S—维格列汀定量目标峰的质子数；

m_S—维格列汀样品的质量，mg。

与现有技术相比，本发明有如下创新性及优势：

(1)本发明首次运用氢核磁共振对维格列汀进行了定量分析，克服了维格列汀中含有的金刚烷基、吡咯烷基、仲胺基、羟基、酮基及腈基相互作用对维格列汀质子共振峰影响较大从而难以通过氢核磁共振检测维格列汀纯度的困难；

(2)本发明系统测定了可用于氢核磁定量的目标信号的T₁值，在此基础上深入讨论了仪器脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等参数对含量测定结果的影响，确保了所建立的维格列汀纯度检测方法的准确性；

(3)本发明选择化学位移(δ_H)为4.78ppm的共振峰为定量目标峰，检测结果准确性更高、计算更为简便、检测速度更快；

(4)本发明维格列汀样品前处理简单，分析时间短，无需测试维格列汀的对照品，重现性好，方便开展无紫外吸收的新药品种的含量分析及质量控制，解决了该品种新药开发中维格列汀纯度测定的技术问题；

(5)本发明选择23℃的进行测试，即保证了较少的消耗液氮，保证核磁共振仪的长时间运行，又提高了核磁共振图谱的分辨率，增加了检测维格列汀纯度的准确性；

(6)本发明选择维格列汀的检测浓度为13-15mg/mL，既保证了核磁共振仪能够准确检测共振信号，又能破坏仲胺基和羟基处氢键的形成，从而进一步提高了检测维格列汀纯度的准确性。

附图说明

图1为维格列汀结构式；

图2为实例1中核磁共振氢谱图；

图3为实例2中核磁共振氢谱图；

图4为实例3中核磁共振氢谱图；

图5为实例4中核磁共振氢谱图；

图6为实例5中核磁共振氢谱图；

图7为实例6中核磁共振氢谱图；

图8为实例7中核磁共振氢谱图；

图9为实例8中核磁共振氢谱图；

图10为实例9中核磁共振氢谱图；

图11为实例10中核磁共振氢谱图；

图12为实例11中核磁共振氢谱图；

图13为实例12中核磁共振氢谱图；

图14为实例13中核磁共振氢谱图；

图15为实例14中核磁共振氢谱图。

具体实施方式

称取维格列汀6.539mg、顺丁烯二酸0.654mg，分别置于核磁管中，加入0.5mL DMSO-d₆溶解，用于¹H NMR测试。采用质子反转-恢复T₁实验方法测定各定量目标峰的纵向弛豫时间T₁，并用Bruker的T₁计算程序计算。设定脉冲弛豫延迟时间范围为1秒至30秒。经测定以DMSO-d₆为溶剂时，顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰T₁为2.5s，维格列汀δ_H 4.78处信号T₁为1.7s。

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

精密称取维格列汀样品8.719mg、顺丁烯二酸4.706mg，分别以600μL、250μL DMSO-d₆溶解，后精密取450μL维格列汀溶液、50μL顺丁烯二酸溶液转移到核磁管中，进行¹H NMR测试。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为100s，采样累加次数为16次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图2所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.15，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为85.7％，重复6次，标准误差0.16％，相对标准偏差0.1％。

W％＝(m_IS×H_IS×A_S×M_S×100％)/(M_IS×A_IS×H_S×m_S) (公式-1)

其中：W％—维格列汀的纯度；

m_IS—内标物的真实质量，0.932mg；

H_IS—内标物定量目标峰的质子数，为2；

A_S—维格列汀定量目标峰的积分值，为1.15；

M_S—维格列汀的摩尔质量，303.40g/mol；

M_IS—内标物的摩尔质量，116.07g/mol；

A_IS—内标物定量目标峰的积分值，为1；

H_S—维格列汀定量目标峰的质子数，为1；

m_S—维格列汀样品的质量，6.539mg。

实施例2

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为80s，采样累加次数为16次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图3所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.15，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为85.7％，重复6次，标准误差0.18％，相对标准偏差0.2％。

实施例3

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为50s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s，重复6次，标准误差＝0.20％，相对标准偏差0.3％。

如图4所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.15，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为85.7％，重复6次，标准误差0.18％，相对标准偏差0.1％。

实施例4

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为30s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图5所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

实施例5

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为25s，采样累加次数为16次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图6所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.15，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为85.7％，重复6次，标准误差0.15％，相对标准偏差0.1％。

实施例6

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为20s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图7所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.17，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为87.2％，重复6次，标准误差0.17％，相对标准偏差0.1％。

实施例7

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为15s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图8所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.17，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为87.2％，重复6次，标准误差0.17％，相对标准偏差0.1％。

实施例8

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为13s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图9所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.17，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为87.2％，重复6次，标准误差0.17％，相对标准偏差0.1％。

实施例9

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d₁为15s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为2.0s。

如图10所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

实施例10

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d₁为30s，采样累加次数为16次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图11所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

实施例11

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d₁为20s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图12所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.17，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为87.2％，重复6次，标准误差0.17％，相对标准偏差0.1％。

实施例12

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d₁为15s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图13所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

实施例13

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d₁为13s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为4.1s。

如图14所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

实施例14

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d₁为15s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为2.0s。

如图15所示，在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

实施例15

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d₁为8s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为2.0s。

在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

实施例16

¹H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d₁为6s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为23℃，AQ为2.0s。

在¹H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δ_H 6.01信号峰积分值为1，维格列汀δ_H 4.78处信号积分值为1.16，根据公式-1可计算得到维格列汀的纯度为86.4％，重复6次，标准误差0.22％，相对标准偏差0.2％。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。