本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及检测血清中C-反应蛋白(CRP)含量的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法。
背景技术：
C-反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)由肝细胞合成，在胎儿期产生，非母体胎盘传递。其产生机理是：当机体受感染或组织受损伤时巨噬细胞和其他白细胞等被激活，产生白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子TNF-a等细胞因子及其他介导物，这些细胞因子和介导物到达肝脏，刺激肝细胞和上皮细胞合成CRP。在结构上，CRP含5个多肽链亚单位，非共价地结合为盘形多聚体，分子量为11.5万～14万，CRP是一种典型的急性时相蛋白。
常规CRP测定包括定性、半定量和定量分析，可用于评价感染，组织损伤和炎症性疾病。对于常规的CRP测定，参考值通常被认为是临床上含量高于10毫克/升。在健康人群血液中CRP水平低于5毫克/升，而在各种条件下，急性炎症4～8小时内，CRP值达到约20至500毫克/升。常规CRP作为急性炎症评估指标比红细胞沉降率(ESR)和白细胞计数更敏感、更可靠。
超敏C反应蛋白常见的用途可作为心血管疾病风险识别的辅助手段。配合传统的急性冠脉综合征临床诊断使用，可作为冠状动脉疾病或急性冠脉综合征复发的预警指示物。
人类在组织损伤的急性期，肝脏合成的一些血浆蛋白显著增加，这些蛋白质通称为急性时相蛋白，C反应蛋白(CRP)是急性时相蛋白中变化最显著的一种。
CRP在正常人血清中其含量极微；在组织受到损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时CRP可以在数小时内急剧上升，CRP被广泛应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，其升高可见于：1、组织损伤、感染、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病；2、术后感染及并发症的指标：手术后病人CRP升高，术后7-10天CRP水平应下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并发感染或血栓栓塞；3、可作为细菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断：大多数细菌性感染会引起患者血清CRP升高，而病毒性感染则多数不升高。近年来研究发CRP水平还同未来发生心血管疾病密切相关，大量研究资料表明，动脉粥样化也是一个慢性炎症过程，CRP轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独立的危险因素；高敏CRP(Hs-CRP)水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2倍，发生心肌梗死的几率是正常者的3倍。2003年欧洲高血压防治指南(ESH/ESC)正式推荐，高血压患者需检测hs-CRP水平。
超敏C反应蛋白线性范围低端低于常规CRP，这种较低的范围可扩大使用适应症，C反应蛋白是非特异性的，必须结合临床症状综合评估，不能作为特定的疾病或疾病的风险的确诊依据。
现有技术中，C-反应蛋白的检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中，C-反应蛋白的检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要的问题，提供一种准确度高的采用磁微粒化学发光法测定人血清中骨钙素(BGP)含量的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种全程C-反应蛋白的测试试剂盒，包括主试剂包、标准曲线卡、和质控品质控单组成；
主试剂包包括以下组分：
校准品，所述校准品为添加了不同量CRP抗原的含BSA的缓冲液的校准品、
CRP抗试剂A，所述CRP抗试剂A为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CRP抗体连结物，含BSA的缓冲液；
CRP抗试剂B，所述CRP抗试剂B为碱性磷酸酶(AP)标记的CRP抗体连结物，含BSA的缓冲液；
磁微粒试剂，所述磁微粒试剂为磁微粒与羊抗FITC抗体连接物、含BSA的缓冲液；
质控品，所述质控品为分别添加了不同量的CRP抗原的含BSA的缓冲液；
分别配制校准品、CRP抗试剂A、CRP抗试剂B、磁微粒试剂，独立地置于包装容器内，得到全程C-反应蛋白的测试试剂盒；
主曲线卡为含6个浓度梯度校准点及对应发光值，用于拟合生成主曲线；
质控品质控单提供质控品质控范围。
进一步的，该试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液为BSA的溶液。
进一步的，该试剂盒还包括浓缩清洗液，所述浓缩清洗液是含有Tris、NaCl和表面活性剂的缓冲液。
进一步的，该试剂盒还包括发光底物溶液，所述发光底物溶液是含LumigenAPS-5发光液的缓冲液。
本发明所提供的试剂盒检测时需要对待测样品进行前处理，处理方法包括以下步骤：
1、样品前处理
对临床血清，3000rpm离心5分钟，取上层液即可进行分析测定。待测样品2-8℃存放不得超过48小时，若48小时未检测，应于-20℃以下保存，但不应超过30天。
2、实验前准备
实验前需将所有试剂放置至室温；准备好一次性平底试管和磁分离器及温育时用于覆盖磁分离器的塑料膜；调节水浴箱温度为37℃；准备化学发光测定仪，并仔细阅读仪器使用说明书。
3、试剂准备
实验前将试剂盒中各试剂置混匀仪上充分混匀；磁微粒试剂混匀后应为均匀悬浊液，无明显凝集。
4、利用上述检测CRP的化学发光免疫分析试剂盒检测样品。本发明的检测方法如下：
该全程C-反应蛋白的测试试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)加样与免疫反应：取三支试管分别加入15μL校准品、15μL质控品和15μL待测样本；
(2)、每支试管中加入30μL抗试剂A和30ul抗试剂B,用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后，置于37℃下水浴15min；
(3)、每支试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；
(4)洗涤：将试管在磁分离器上静置2分钟，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干；
(5)、每管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置2分钟，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干；重复3次；
(6)每个试管加入200μL发光底物，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。
本发明具有以下优点：
1、使用磁珠为固相，使免疫反应更接近液相，反应更充分和迅速，而且使结合的免疫复合物更加容易分离，降低了非特异性吸附。
2、使用的抗试剂为单克隆抗体混合物，使免疫反应的亲和力更高，而且单抗的生产批间差异相对小，更容易保证产品的批间稳定。
3、使用化学发光底物溶液，使检测的灵敏度得到了提高，而且线性范围更宽。
4、本方法的建立可以为其他试剂盒的开发提供一种方便、高灵敏度、准确性和稳定性的免疫检测方法。
本发明的主要创新之处在于：
1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
2、试剂盒中的磁微粒试剂、抗试剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、发光底物溶液及样本稀释液是该反应体系下的最优配方，给试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
本发明的检测CRP的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒主要采用直接夹心法定量检测人血清等样品中CRP的含量；对样品的前处理要求低，前处理过程简单，能快速、高通量检测大批样品；采用了高特异的单克隆抗体和超顺磁、高分散、比表面积大的磁微粒子，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利。
本发明的主要优点如下：
1、临床上常规CRP检测试剂盒，其最低检测限一般为3～5mg/L，灵敏度较低。本发明所述试剂盒灵敏度比较高，线性范围比较宽，可同时对感染性疾病、心脑血管疾病等进行诊断。
2、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有的技术相比，本发明具有更高的特异性，灵敏度，获得检测结果的时间短，操作方式简便。
3、本发明与其他常规检测方法相比，具有稳定性好、检测结果准确等优势。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的结构示意图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一、磁珠缓冲液配制操作规程：以配制1L为例：
1、根据配制量，选择合适容器，加入0.7kg700ml的纯水；
2、称取Tris 6.02g，NaN3 0.99g于容器中，混匀，室温搅拌2小时；
3、检测溶液pH，应在10左右；
4、调制pH值为8.0；
5、量取Tween-20 2.76ml；称取硫酸新霉素0.99g；四环素0.03g；BSA 4.97g于容器中，搅拌1小时，调pH值至8.0±0.05；
6、定容至1L，调pH值至8.0±0.05；
7、用0.22um滤器过滤，贮存于4℃。
二、磁微粒试剂的制备过程
将直径为0.1微米的四氧化三铁微球用戊二醛进行活化，室温混匀4小时后，用0.01mol/L PBS pH7.4缓冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50-100mg/ml；然后，每毫升悬液中加入羊抗FITC抗体100μg，于37℃混匀温育3-8小时；用等体积的0.01mol/L PBS 5％BSA pH7.4缓冲液于37℃封闭40分钟；最后，用0.5％BSA 0.02mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液清洗三次，并用上述磁珠缓冲液配制一定浓度的工作液。
二、碱性磷酸酶AP与抗CRP单克隆抗体的偶联
抗体为免疫球蛋白，含有氨基(-NH2)，使用SMCC活化剂进行活化，生成马来酰亚胺-免疫球蛋白；马来酰亚胺-免疫球蛋白含有可以与-SH基团反应的马来酰亚胺基团，加入含有-SH的碱性磷酸酶，可以将抗体与碱性磷酸酶连接在一起。
三、异硫氰酸荧光素FITC与抗AFP单克隆抗体的偶联
FITC分子与CRP单克隆抗体的偶联物是以常见的碱性液标记法对抗体进行标记。当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一般最多能结合15-20个，一个IgG分子可结合2-8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N＝C＝S+-NH2-蛋白质→FITC-NS-C-NH2-蛋白质
四、校准品/质控品的配制：
1、最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积溶液时，需加入原料的体积分别如表1所示；
表1校准品的配制
2、全程C-反应蛋白(CRP)测定试剂盒CRP校准品原料(浓度为100ug/ml)用样本稀释液(具体配方见实施例6)配制成浓度点为6个浓度点。
3、完全溶解后，贴好标签于2-8℃保存，有效期为12个月。
五、清洗浓缩液配制操作规程：以配制1L为例：
1、根据配制量，选择合适的容器，加入出水700ml，称取Tris 12.11g；NaCl 312.43g；Tween-20 27.74g；Bronidox 1g；Triton X-1001g；
2、放置18小时，调pH至8.6±0.05；加纯水至1L，过滤。
3、使用时进行15倍稀释。
六、发光底物溶液配制操作规程：以配制1L为例：
1、根据配制量，选择合适的容器，称取Tris 36.36g；Na2SO3 10mg；SDS 1.0g；光泽精3.27mg；Tween-20 0.31ml调pH至9.35；加纯水至1L，过滤。
2、测试发光值
七、样本稀释液配制操作规程：以配制1L为例：
1、加入500ml纯水于容器中，称取三羟基氨基甲烷6g；NaCl 8.8g；BSA 60g；Proclin 300 1ml，调pH至7.5±0.05。
2、纯水定容至1L，过滤。
检测结果：
检测曲线见图1。
对零标准点进行20次重复测试，取零标准点测定的平均值加上2倍的标准差，即为其灵敏度。本方法的灵敏度为≤1ug/ml。
临床试验
一、检测结果分析
1.由于方法学或抗体特异性等原因，使用不同生产商的试剂对同一份样本进行检测可能会得到不同的检测结果，因此，用不同试剂检测所得结果不应直接相互比较，以免造成错误的医学解释。
2.质控品可作为当次实验结果可信度的参考依据，其测定值应在本批产品的质控单允许的范围之内。当检测结果靠近参考值范围的上限值时，可考虑对样本进行确认试验。
3.本试剂的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
4.CRP是一种急性时相性反应蛋白，在炎症、组织损伤时常迅速升高。由于它具有活化补体和促进吞噬的功能，因此在非特异的抗感染方面可起重要作用。血清中CRP含量升高可见于多种病理情况：
感染：手术后感染，SLE或白血病并发感染，新生儿或婴儿败血症，细菌性脑膜炎，儿童有症状的尿路感染，各种细菌、病毒、支原体感染。
炎症、变态反应、自身免疫病、风湿热、心肌梗塞、肺梗塞、恶性肿瘤、烧伤等疾病均可引起血清CRP水平增高。
二、本发明试剂盒性能指标
1.线性
线性范围(0.6～175.0)ng/mL，相关系数r≥0.9900。
2.准确度
偏差≤±10％。
3.最低检测限
最低检测限≤0.5ng/mL。
4.重复性
变异系数CV≤8％。
5.批间差变异系数CV≤15％。
6.单位换算
mg/L＝1000ng/mL。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。