一种量子点标记过滤富集快速检测沙门氏菌的方法与流程

本发明属于微生物快速检测技术领域，尤其是涉及一种快速检测沙门氏菌的方法。

背景技术：

目前，由沙门氏菌引起的食物中毒是越来越多的，据美国疾病控制中心报告表示，由沙门氏菌引起的细菌性食物中毒是居首位的，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大甚至高达45％。沙门氏菌是食物中毒、菌群失调性腹泻的主要病原体，其不仅在食品污染中占据着十分重要的位置，同时也是临床上非常重要的感染病原体之一，它与艾滋病、乙型肝炎并列为世界的三大感染顽疾。

现今，沙门氏菌的检测方法主要有传统的免疫学检测法、核酸检测法和分离鉴定法等，其中，分离鉴定法耗时耗力，而其它两种方法均要求微生物信号的转化、富集，近年来，利用量子点的荧光特性以及功能磁珠的快速分离富集的方法被广泛的应用，但是，该法的检测效率高低部分取决于磁珠的捕获效率，降低了检测信号的富集。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种量子点标记过滤富集快速检测沙门氏菌的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种量子点标记过滤富集快速检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：

(1)用EDC.活化谷胱甘肽修饰的CdTe量子点的羧基后，与沙门氏菌特有蛋白IsdA的兔抗体，在20-25℃共培养1-4h，超滤；弃滤液，得到复合物；

所述EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写；

(2)取1ml待测样品，离心，用浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤后加入到步骤(1)得到的复合物中，30-37℃共培养1-4h；

所述PBS为磷酸盐缓冲液的缩写；

(3)将步骤(2)获得的的共培养混合物吸入1ml的无菌注射器中，用0.45μm的滤膜过滤，另取1ml注射器，吸入浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤3-5次，再用吐温-20的体积百分含量为0.05％的含吐温-20的浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤3-5次，洗涤后的剩余物在355纳米紫外灯照射下观察是否有荧光，有荧光则说明有沙门氏菌，没有荧光则没有沙门氏菌。

本发明的方法采用量子点作为检测信号，并用无菌注射器和滤膜组合进行信号富集，借助紫外进行检测，此法快速，简便，准确。首先CdTe量子点具有非常稳定的光学特性，这保证了最终检测信号的稳定性；其次，抗体的特异性以及专一性决定了实验的准确性，最后，仅用注射器和滤膜即可进行富集，快捷，简单。由于是对所有菌体的拦截，这就保证了检测信号的有效富集，同时对于过滤而出的CdTe量子点和抗体的复合物可进行重复循环使用，增加了抗体的利用率，最大化减少损失，降低成本。本发明的方法法可衍生应用于其它微生物检测，相对于国标检测的方法，本法更为快速，简便，具有良好的应用前景。

附图说明

图1 CdTe量子点紫外荧光发光图。

由图1可知，试验用CdTe量子点发黄色荧光，最佳发射波长为555nm，CdTe量子点的发射峰对称且窄，同时CdTe量子点的荧光强度可达到28000左右，保证的续实验的信号强度。

图2为本发明实施例检测结果。1、2、3依次为实施例1、实施例2和实施例3的效果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。要强调的是，各实施例和附图是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不能本发明作任何限制。

IsdA兔抗体为常规方法制备。

其他：1ml无菌注射器、0.45um滤膜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠均为市售，使用前需灭菌。

各实施例中：所述EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写；所述PBS为磷酸盐缓冲液的缩写。

实施例1

一种量子点标记过滤富集快速检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：

(1)称取26.6mg的二水醋酸镉，加入50mL去离子水，加入36.84mg的谷胱甘肽，混合均匀，调节pH至10.5，得溶液一；称取5.08mg的亚碲酸钾，加入50mL去离子水，得溶液二，将溶液一和溶液二混合，100℃回流1h，得到谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，使用前，使用30kDa的超滤管浓缩20倍；

吸取100μl浓度为4mg/ml的EDC水溶液，加入200ul谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，放置30min用EDC对谷胱甘肽修饰的CdTe量子点的羧基进行活化，加入300ul沙门氏菌特有蛋白IsdA的兔抗体，在25℃共培养1h，100kDa超滤管超滤，弃滤液，得到复合物；

(2)取1ml对数期的沙门氏菌为待测样品，离心，用浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤后加入到200μl步骤(1)得到的复合物中，37℃共培养1h；

(3)将步骤(2)获得的共培养混合物吸入1ml的无菌注射器中，用0.45μm的滤膜过滤，另取1ml注射器，吸入浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤3次，再用吐温-20的体积百分含量为0.05％的含吐温-20的浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤3次，洗涤后的剩余物在355纳米紫外灯照射下观察有荧光，说明有沙门氏菌。

步骤(2)待测样品沙门氏菌用无菌水替代，其它同本实施例，其洗涤后的剩余物在355纳米紫外灯照射下观察没有荧光，说明没有沙门氏菌。说明本发明的方法具有特异性。

对照例1

(1)取200ul谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，不加沙门氏菌特有蛋白IsdA的兔抗体，而加300ul无菌水；

(2)取1ml对数期的沙门氏菌为待测样品，离心，用浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤后加入200μl步骤(1)获得的液体中，37℃共培养1h；

(3)将步骤(2)获得的共培养混合物吸入1ml的无菌注射器中，用0.45μm的滤膜过滤，另取1ml注射器，吸入浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤3次，再用吐温-20的体积百分含量为0.05％的含吐温-20的浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤3次，洗涤后的剩余物在355纳米紫外灯照射下观察没有荧光(但样品中放入了沙门氏菌)。

实施例2

一种量子点标记过滤富集快速检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：

(1)称取26.6mg的二水醋酸镉，加入50mL去离子水，加入36.84mg的谷胱甘肽，混合均匀，调节pH至10.5，得溶液一；称取5.08mg的亚碲酸钾，加入50mL去离子水，得溶液二，将溶液一和溶液二混合，100℃回流1h，得到谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，使用前，使用30kDa的超滤管浓缩20倍；

吸取100μl浓度为4mg/ml的EDC水溶液，加入200ul谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，放置30min用EDC对谷胱甘肽修饰的CdTe量子点的羧基进行活化，加入300ul沙门氏菌特有蛋白IsdA的兔抗体，在20℃共培养4h，100kDa超滤管超滤，弃滤液，得到复合物；

(2)取1ml对数期的沙门氏菌为待测样品，离心，用浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤后加入200μl步骤(1)获得的液体中，30℃共培养4h；

(3)将步骤(2)获得的共培养混合物吸入1ml的无菌注射器中，用0.45μm的滤膜过滤，另取1ml注射器，吸入浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤5次，再用吐温-20的体积百分含量为0.05％的含吐温-20的浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤5次，洗涤后的剩余物在355纳米紫外灯照射下观察有荧光，说明有沙门氏菌。

实施例3

一种量子点标记过滤富集快速检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：

(1)称取26.6mg的二水醋酸镉，加入50mL去离子水，加入36.84mg的谷胱甘肽，混合均匀，调节pH至10.5，得溶液一；称取5.08mg的亚碲酸钾，加入50mL去离子水，得溶液二，将溶液一和溶液二混合，100℃回流1h，得到谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，使用前，使用30kDa的超滤管浓缩20倍；

吸取100μl浓度为4mg/ml的EDC水溶液，加入200ul谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，放置30min用EDC对谷胱甘肽修饰的CdTe量子点的羧基进行活化，加入300ul沙门氏菌特有蛋白IsdA的兔抗体，在22℃共培养3h，100kDa超滤管超滤，弃滤液，得到复合物；

(2)取1ml对数期的沙门氏菌为待测样品，离心，用浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤后加入200μl步骤(1)获得的液体中，35℃共培养3h；

(3)将步骤(2)获得的共培养混合物吸入1ml的无菌注射器中，用0.45μm的滤膜过滤，另取1ml注射器，吸入浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤4次，再用吐温-20的体积百分含量为0.05％的含吐温-20的浓度为5g/L、pH＝7.5的PBS洗涤4次，洗涤后的剩余物在355纳米紫外灯照射下观察有荧光，说明有沙门氏菌。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。