本发明涉及一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器的制备方法及应用，具体涉及一种三联吡啶钌作为发光材料，利用树枝状Fe2O3@Au优良的生物兼容性和大的比表面积作为基底材料增加抗体的固载量，用Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+作为二抗标记物，属于电化学发光检测技术领域。
背景技术：
近年来，肝癌的发病率居高不下，死亡率逐年增加，原因大多在于对肝癌的发现不够及时，到发现时已是肝癌晚期而错过最佳的治疗时间。通过近年的研究发现，甲胎蛋白AFP、鳞状细胞癌抗原SCCA、癌胚抗原CEA、糖链抗原CA15-3等可以作为肝癌标志物，它们在肝癌的早期预防和治疗中发挥着重要的作用。对血清中肝癌标志物的浓度进行快速、灵敏检测具有非常重要的临床价值和意义，能够在最大程度上降低肝癌的死亡率，延长肝癌患者的生存期限，为患者争取更多的治疗机会。
目前用于检测肝癌标志物的方法主要是放射性免疫法和化学发光免疫法，但这些方法存在不能即时快速检测、具有放射性污染以及操作复杂等弊端，而电化学免疫传感器能够很好地克服这些弊端，它是一种基于抗原与抗体特异性识别而构建的免疫传感器，凭借着其制备简单、灵敏度高、检测限低、响应速度快的优点，能够对抗原进行快速灵敏的检测。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的肝癌标志物检测方法存在的问题，提供一种简单快速可靠的基于树枝状Fe2O3@Au和Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+的电化学发光传感器的制备方法和应用，实现对肝癌标志物的快速、灵敏、特异、高效检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、浓度为2 ~ 4 mg/mL的抗体Ab1捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液至电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（5）滴涂6 μL、浓度为2 ~ 4 mg/mL的二抗Ab2标记物Pd-graphene/Fe3O4 -Ru(bpy)32+/Ab2溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器。
2. 抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液的制备
（1）将0.05 ~ 0.20 g的铁氰化钾固体溶于5 ~ 50 mL超纯水中，用0.001 ~ 0.020 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至10.0 ~ 12.0，继续搅拌1 ~ 15 min，将混合溶液放入高压反应釜中，在60 ~ 150 °C下反应6 ~ 24 h，将产品在6000 ~ 8000 rpm下离心分离并用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，放入真空干燥箱，30 ~ 60 °C下干燥2 ~ 5 h，制得砖红色的树枝状Fe2O3；
（2）将40 ~ 100 mL、质量分数为0.001 ~0.010%的氯金酸溶液煮沸，加入1 ~ 3 mL、质量分数为0.1 ~ 1.0%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流5 ~ 20 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，制得金纳米粒子溶液，4°C下避光保存；
（3）将0.5 ~ 3 mg的树枝状Fe2O3分散到1 mL超纯水中，加入0.5 ~ 1.5 mL金纳米粒子溶液，将混合溶液在室温下振荡12 ~ 32 h，离心分离，除去过量的金纳米粒子，制得Fe2O3@Au，将产物Fe2O3@Au重新分散到1 mL超纯水中，制得基底材料Fe2O3@Au溶液；
（4）在1 ~ 3 mL、浓度为2 ~ 4 mg/mL Fe2O3@Au溶液中，加入100 ~ 400 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab1溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab1，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液，储存在4 °C下备用。
3. 二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液的制备
（1）将0.1 ~ 2 mL、浓度为12 mol/L盐酸溶液加入到5 ~ 30 mL的超纯水中，随后向溶液中加入0.5 ~ 6.0 g三氯化铁固体和0.5 ~ 6.0 g 氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到100 ~ 500 mL、浓度为0.5 ~ 5.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，在4000 ~ 8000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入200 ~ 600 mL、浓度为0.01 ~ 0.04 mol/L的盐酸溶液，在6000 ~ 9000 rpm的转速下离心分离5 ~ 15min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将1 ~ 5 mL Fe3O4纳米溶胶加入到40 ~ 200 mL、浓度为1.0 ~ 3.0 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.10 ~ 0.60 g亚硫酸氢钠固体，在80 ~ 160 °C下反应2 ~ 6 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后可得到3D结构的graphene/Fe3O4；
（3）将0.06 ~ 0.20 g四氯钯酸钠固体和0.06 ~ 0.20 g柠檬酸钠固体溶于10 ~ 100 mL超纯水中，向溶液中加入0.1 ~ 4.0 mL、浓度为0.005 ~ 0.020 mol/L硼氢化钠溶液，持续搅拌30 ~ 90 s，制得黑色的Pd纳米粒子溶液；
（4）将1 ~ 3 mL、浓度为2 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与1 ~ 3 mL的Pd纳米粒子溶液混合，避光振荡24 ~ 48 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，与1 ~ 3 mL、浓度为1×10-3 mol/L Ru(bpy)32+溶液混合振荡24 ~ 48 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，制得Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液；
（5）在1 ~ 3 mL、浓度为2 ~ 4 mg/mL Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液中，加入100 ~ 400 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab2，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液，储存在4 °C下备用。
4. 制备的电化学发光传感器用于待测样品的电化学检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.2 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.4 ~ 8.4的含浓度为35 ~ 65 mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
5.待测物抗原选自下列肝癌标志物之一：甲胎蛋白AFP、鳞状细胞癌抗原SCCA、癌胚抗原CEA、糖链抗原CA15-3。
本发明的有益成果
（1）电化学发光传感器制备方法，以Ru(bpy)32+为发光材料，利用Ru(bpy)32+良好的光学性质，构建的传感器具有更高的灵敏度。
（2）以Fe2O3@Au作为抗体捕获基底，Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+作为二抗标记物，Fe2O3@Au和Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+生物兼容性好，比表面积大等优点有效地增加了抗体的固载量。
（3）本发明制备的电化学发光传感器用于肝癌标志物的检测，操作简单，反应快速，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、灵敏、特异性检测。
实施例1 一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴加6 μL、2 mg/mL的抗体Ab1捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液至电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化0.5 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（5）滴加6 μL、浓度为2 mg/mL二抗Ab2标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+ /Ab2溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器。
实施例2 一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴加6 μL、3 mg/mL的抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液与电极表面，4 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化1.5 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（5）滴加6 μL、浓度为3 mg/mL二抗Ab2标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+ /Ab2溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器。
实施例3 一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴加6 μL、4 mg/mL的抗体Ab1捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液与电极表面，4°C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、一定浓度的待测物抗原，4 °C下孵化2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
（5）滴加6 μL、浓度为4 mg/mL二抗Ab2标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+ /Ab2溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液冲洗电极表面，4 °C晾干后，制得一种基于树枝状Fe2O3@Au的电致化学发光传感器。
实施例4 抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液的制备
（1）将0.05 g的铁氰化钾固体溶于10 mL超纯水中，用0.001 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至10.0，继续搅拌5 min，将混合溶液放入高压反应釜中，在80 °C下反应8 h，将产品在6000 rpm下离心分离并用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，放入真空干燥箱，30 °C下干燥2 h，制得砖红色的树枝状Fe2O3；
（2）将40 mL、质量分数为0.001%的氯金酸溶液煮沸，加入1 mL、质量分数为0.1 %的柠檬酸三钠水溶液，加热回流5 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，制得金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（3）将0.5 mg的树枝状Fe2O3分散到1 mL超纯水中，加入0.5 mL金纳米粒子溶液，将混合溶液在室温下振荡12 h，离心分离，除去过量的金纳米粒子，制得Fe2O3@Au，将产物Fe2O3@Au重新分散到1 mL超纯水中，制得基底材料Fe2O3@Au溶液；
（4）在1 mL、浓度为2 mg/mL Fe2O3@Au溶液中，加入100 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab1溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab1，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液，储存在4 °C下备用。
实施例5 抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液的制备
（1）将0.15 g的铁氰化钾固体溶于25 mL超纯水中，用0.01 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至11.0，继续搅拌8 min，将混合溶液放入高压反应釜中，在120 °C下反应12 h，将产品在7000 rpm下离心分离并用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，放入真空干燥箱，40 °C下干燥3 h，制得砖红色的树枝状Fe2O3；
（2）将80 mL、质量分数为0.005%的氯金酸溶液煮沸，加入1.5 mL、质量分数为0.5%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流10 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，制得金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（3）将1 mg的树枝状Fe2O3分散到1 mL超纯水中，加入1 mL金纳米粒子溶液，将混合溶液在室温下振荡18 h，离心分离，除去过量的金纳米粒子，制得Fe2O3@Au，将产物Fe2O3@Au重新分散到1 mL超纯水中，制得基底材料Fe2O3@Au溶液；
（4）在2 mL、浓度为3 mg/mL Fe2O3@Au溶液中，加入200 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab1溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab1，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液，储存在4 °C下备用。
实施例6 抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液的制备
（1）将0.19 g的铁氰化钾固体溶于40 mL超纯水中，用0.015 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至12.0，继续搅拌15 min，将混合溶液放入高压反应釜中，在140 °C下反应24 h，将产品在8000 rpm下离心分离并用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，放入真空干燥箱，50 °C下干燥4 h，制得砖红色的树枝状Fe2O3；
（2）将100 mL、质量分数为0.010%的氯金酸溶液煮沸，加入2 mL、质量分数为1.0%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流15 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，制得金纳米粒子溶液，4 °C下避光保存；
（3）将2 mg的树枝状Fe2O3分散到1 mL超纯水中，加入1.5 mL金纳米粒子溶液，将混合溶液在室温下振荡32 h，离心分离，除去过量的金纳米粒子，制得Fe2O3@Au，将产物Fe2O3@Au重新分散到1 mL超纯水中，制得基底材料Fe2O3@Au溶液；
（4）在3 mL、浓度为4 mg/mL Fe2O3@Au溶液中，加入400 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab1溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab1，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得抗体捕获基底材料Fe2O3@Au/Ab1溶液，储存在4 °C下备用。
实施例7 二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液的制备
（1）将0.4 mL、浓度为12 mol/L 盐酸溶液加入到13 mL的超纯水中，随后向溶液中加入2.6 g三氯化铁固体和1.6g 氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到125 mL、浓度为1.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，在4000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入250 mL、浓度为0.01 mol/L的盐酸溶液，在6000 rpm的转速下离心分离5 min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将2.5 mL Fe3O4纳米溶胶加入到50 mL、浓度为1.5 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.22 g亚硫酸氢钠固体，在95 °C下反应3 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后得到graphene/Fe3O4；
（3）将0.07 g四氯钯酸钠固体和0.07 g柠檬酸钠固体溶于20 mL超纯水中，向溶液中加入0.6 mL，浓度为0.01 mol/L硼氢化钠溶液，持续搅拌30 s，制得黑色的Pd纳米粒子溶液；
（4）将1 mL、浓度为2 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与1 mL的Pd纳米粒子溶液混合，避光振荡24 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，与1 mL、浓度为1×10-3 mol/L Ru(bpy)32+溶液混合振荡24h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，制得Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液；
（5）在1 mL、浓度为2 mg/mL Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液中，加入100 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab2溶液，在4°C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab2，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液，储存在4 °C下备用。
实施例8 二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液的制备
（1）将1.5 mL、浓度为12 mol/L 盐酸溶液加入到20 mL的超纯水中，随后向溶液中加入3.0 g三氯化铁固体和4.0 g 氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到300 mL、浓度为3.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，在6000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入400 mL、浓度为0.03 mol/L的盐酸溶液，在7000 rpm的转速下离心分离10 min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将2 mL Fe3O4纳米溶胶加入到100 mL、浓度为2.0 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.40 g亚硫酸氢钠固体，在120 °C下反应4 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后得到graphene/Fe3O4；
（3）将0.15 g四氯钯酸钠固体和0.15 g柠檬酸钠固体溶于80 mL超纯水中，向溶液中加入3.0 mL、浓度为0.015 mol/L硼氢化钠溶液，持续搅拌60 s，制得黑色的Pd纳米粒子溶液；
（4）将2 mL、浓度为2 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与2 mL的Pd纳米粒子溶液混合，避光振荡32 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，与2 mL、浓度为1×10-3 mol/L Ru(bpy)32+溶液混合振荡32 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，制得Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液；
（5）在2 mL、浓度为3 mg/mL Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液中，加入200 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab2，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液，储存在4 °C下备用。
实施例9 二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液的制备
（1）将2 mL、浓度为12 mol/L 盐酸溶液加入到30 mL的超纯水中，随后向溶液中加入6.0 g三氯化铁固体和6.0 g 氯化亚铁固体，在持续搅拌下，将混合溶液逐滴地加入到500 mL、浓度为5.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，在8000 rpm的转速下进行离心分离，用超纯水洗涤三次，之后向沉淀中加入600 mL、浓度为0.04 mol/L的盐酸溶液，在9000 rpm的转速下离心分离15 min，弃去上清液，加入超纯水进行超声得到黄色的Fe3O4纳米溶胶；
（2）将5 mL Fe3O4纳米溶胶加入到200 mL、浓度为3.0 mg/mL氧化石墨烯分散悬液中，在搅拌下，加入0.60 g亚硫酸氢钠固体，在160 °C下反应6 h，冷却后用超纯水透析一周，经冷冻干燥后得到graphene/Fe3O4；
（3）将0.20 g四氯钯酸钠固体和0.20 g柠檬酸钠固体溶于100 mL超纯水中，向溶液中加入4.0 mL，浓度为0.020 mol/L硼氢化钠溶液，持续搅拌90 s，制得黑色的Pd纳米粒子溶液；
（4）将3 mL、浓度为2 mg/mL的graphene/Fe3O4溶液与3 mL的Pd纳米粒子溶液混合，避光振荡48 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，与3 mL、浓度为1×10-3 mol/L的 Ru(bpy)32+溶液混合振荡48 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，制得Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液；
（5）在3 mL、浓度为4 mg/mL Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+溶液中，加入400 μL、浓度为10 μg/mL的待测物抗体Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab2，将产物分散到1 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶液中，制得二抗标记物Pd-graphene/Fe3O4-Ru(bpy)32+/Ab2溶液，储存在4 °C下备用。
实施例10甲胎蛋白AFP的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.2 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.4~8.4的含浓度为35 ~ 65 mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的鳞状细胞癌抗原SCCA产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，测得线性范围为0.001 pg/mL ~ 1 ng/mL，检测限为0.29 fg/mL；
（3）将待测样品溶液代替甲胎蛋白AFP进行检测。
实施例11鳞状细胞癌抗原SCCA的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.2 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.4~8.4的含浓度为35 ~ 65 mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的鳞状细胞癌抗原SCCA产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，测得线性范围为0.001 pg/mL ~ 1 ng/mL，检测限为0.29 fg/mL；
（3）将待测样品溶液代替鳞状细胞癌抗原SCCA进行检测。
实施例12癌胚抗原CEA的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.2 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.4 ~ 8.4的含浓度为35 ~ 65 mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的癌胚抗原CEA产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，测得线性范围为0.001 pg/mL ~ 1 ng/mL，检测限为0.29 fg/mL；
（3）将待测样品溶液代替癌胚抗原CEA进行检测。