一种用液相色谱法分离测定依普利酮及其有关物质的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及液相色谱法分离测定依普利酮及其有关物质的方法。

背景技术：

依普利酮是一种选择性醛固酮受体拮抗药，用于治疗高血压和其他心血管疾病。对血管紧张素转换酶抑制药和血管紧张素II受体抑制药作用不佳的低肾素水平的原发性高血压患者，依普利酮有良好降压效果。此外，还可以显著减轻肾小球的超滤作用，从而减轻高血压患者的白蛋白尿，而这对于合并糖尿病的高血压患者有明显的肾脏保护作用。依普利酮的化学名为9,11α-Epoxy-7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21,17-carbolactone，分子式为C₂₄H₃₀O₆。依普利酮的结构式为：

。

在该化合物的生产过程中，有几个物质可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量，这几个物质即药物质量控制中的有关物质，对于依普利酮的生产质量主要控制的有关物质有10个，分别是3-oxo-17α-pregn-4-ene-7α,9:21,17-dicarbolactone（有关物质1），11α,12α-epoxy-7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21,17-carbolactone（有关物质2），7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-diene-21,17-carbolactone(有关物质3），（2’’R）-9,11α-epoxy-3,5’-dioxo-4’,5’-dihydro-3’H-spiro[androst-4-ene-17,2’-furan]-7α-carboxylic acid（有关物质4），9,11α-epoxy-7β-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21,17-carbolactone（有关物质5），9,11α-epoxy-17-hydroxy-7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21-carboxylic sodium salt（有关物质6），7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21,17-carbolactone（有关物质7），pregna-4-ene-7,21-dicarboxylic acid,11,17-dihydroxy-3-oxo,g-lactone,methyl ester,(7α,11α,17α)-（有关物质8），(2’R,7R,10R,11R,13S)-methyl 10,13-dimethyl-3,5’-dioxo-11-(tosyloxy)-1,2,3,4’,5’,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-hexadecahydro-3’H-spiro[cyclopenta[α]phenanthrene-17,2’-furan]-7-carboxylate（有关物质9），9,11-7β-9,11α-epoxy-7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21,17-carbolactone（有关物质10），结构式分别为：

。

对于依普利酮工艺生产过程中引入的有关物质，在原料药中是需要进行质量控制的，因此，实现依普利酮及其有关物质的分离，在依普利酮质量控制方面具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种分析依普利酮纯度以及分离其有关物质的方法，从而实现依普利酮与其有关物质的分离和测定，从而保证依普利酮的纯度，实现其终产品的质量控制。

本发明所述的用液相色谱法分析依普利酮纯度以及分离其有关物质的方法，是采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液-有机相为流动相。

上述所说的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱选自Kromasil、Alltima和YMC等品牌。

上述所说的有机相选自以下化合物：乙腈、丙醇、异丙醇、四氢呋喃等，优选乙腈。

上述所说的方法，其流动相缓冲盐溶液-有机相采用梯度洗脱。

上述所说的方法中，缓冲盐溶液选自磷酸盐、高氯酸盐，优选磷酸盐。

其中缓冲盐溶液的浓度为0.02～0.1mol/L，优选浓度为0.02mol/L。

本发明所述的分离测定方法，可按照以下方法实现：

1) 取依普利酮样品及其有关物质适量，用乙腈或流动相溶解样品，配制成每1mL含依普利酮0.1～1.5mg的样品溶液；

2) 设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，流动相流速优选为1.0mL/min，检测波长为200～250nm，最佳检测波长为240nm，柱温箱温度为10～40℃，柱温箱温度最佳为40℃；

3) 取1)的样品溶液10～50μL，注入液相色谱仪，完成依普利酮与其有关物质的分离测定。

其中：高效液相色谱仪的型号，无特别要求，本发明采用的色谱仪为岛津高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-M20A检测器，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A控制器，CTO-10AS柱温箱，LC solution工作站；

色谱柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）；

流动相：A：0.02M磷酸二氢铵，B：乙腈；按以下梯度进行洗脱：

流速：1.0mL/min；

检测波长：240nm；

进样体积：20μL；

柱温：40℃。

本发明采用C18（YMC，150×4.6 mm，3μm），能够有效的分离依普利酮及其有关物质。本发明解决了依普利酮及其有关物质的分离测定问题，从而减少了副反应的发生，提高了原料药终产品的收率和纯度，保证了依普利酮的质量可控。

附图说明：

图1为实施例1时依普利酮及其有关物质HPLC图；

图2为实施例1时依普利酮HPLC图；

图3为实施例2时空白溶剂HPLC图；

图4为实施例2时依普利酮及其有关物质HPLC图；

图5为实施例2时依普利酮HPLC图。

具体实施方式：

以下实施例用于进一步理解本发明，但不限于本实施的范围。

实施例1：

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT， CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色谱柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）；

流动相：A：0.1%磷酸水，B：磷酸-乙腈-甲醇（0.1：40：60）；按以下梯度进行洗脱：

流速：1.0mL/min；

检测波长：240nm；

进样体积：20μL；

柱温：30℃。

实验步骤：

取依普利酮及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含依普利酮及其有关物质约1.0mg/mL的样品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1~2，图1中保留时间为10.501min的色谱峰为依普利酮，其余色谱峰为依普利酮各有关物质的色谱峰；图2中保留时间为10.578min的色谱峰为依普利酮。

实施例2：

仪器与条件：

高效液相色谱仪：岛津，LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色谱柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）；

流动相：A：0.02M磷酸二氢铵，B：乙腈；按以下梯度进行洗脱：

流速：1.0mL/min；

检测波长：240nm；

进样体积：20μL；

柱温：40℃。

实验步骤：

取依普利酮及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含依普利酮及其有关物质约1.0mg/mL的样品溶液；另取乙腈适量作为空白溶剂。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图3~5，图3为空白溶剂色谱图；图4中保留时间为27.159min的色谱峰为依普利酮，其余色谱峰为依普利酮各有关物质的色谱峰，由图可以看出，依普利酮与其有关物质能够达到基线分离，符合中国药典的要求；图5中保留时间为27.096min的色谱峰为依普利酮，可以看出在该条件下依普利酮与其有关物质可以完全分离。

对上述依普利酮及其有关物质分析方法的以下项目进行了验证：

系统适用性试验：

根据上述实施例2确定的色谱条件，分别用依普利酮和各有关物质的混合溶液来分析此色谱条件是否符合要求。由图4可见此条件下各个有关物质与主峰之间分离度符合要求，峰纯度和单点阀值均符合要求。

进样重复性试验：

将系统适用性溶液，按实施例2所述色谱条件，重复进样6次，考察方法的重复性。由结果可知，连续6次系统适用性样品中各个有关物质的峰面积RSD均小于1.0%，方法重复性良好。

。

耐用性：

为了进一步验证方法的稳定性，我们将流速、柱温、和色谱柱品牌这些条件进行相应的微调，以考察色谱条件的耐用性。

结果表明，流速变化在±0.2ml/min范围内，柱温变化在±5℃范围内，峰型没有变化，仅保留时间有相应的前移和后移。色谱柱的耐用性考察中，Waters色谱柱分析时出峰较早，但各物质的分离度不满足基线分离。Kromasil色谱柱分析时，各物质保留时间和分离度无明显变化，各物质峰纯度和分离度均符合要求。

检测限：

取依普利酮适量，精密称定，用乙腈溶解样品，配制成相应的供试液，再精密量取供试液适量，逐级稀释，按实施例2的色谱条件进样考察。

依普利酮检测限数据如下表所示：

。