雷米普利分子印迹整体柱及其制备方法与应用与流程

本发明属于高效液相色谱整体柱技术领域，具体涉及一种雷米普利分子印迹整体柱及其制备方法与应用。

(二)

背景技术：

分子印迹技术起源于Pauling的抗体理论，是一种对特定模板分子及其结构类似物具有特异性识别作用的印迹聚合物的制备和分析应用的新兴技术。此技术具有选择性好、稳定性高、使用寿命长和应用范围广等优点，已被广泛应用于样品前处理(Xu Z,Hu Y,Hu Y,et al.Investigation of ractopamine molecularly imprinted stir bar sorptive extraction and its application for trace analysis of beta2-agonists in complex samples[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(22):3612-3618.)、色谱分离(Zhang H,Ye L,Mosbach K.Non-covalent molecular imprinting with emphasis on its application in separation and drug development[J].Journal of Molecular Recognition,2006,19(4):248–259.)、手性药物的拆分(Cormack P A G,Mosbach K.Molecular imprinting:recent developments and the road ahead[J].Reactive&Functional Polymers,1999,41(s 1–3):115-124.)、固相萃取(Pichon V.Selective sample treatment using molecularly imprinted polymers.[J].Journal of Chromatography A,2007,1152(1-2):41–53.c)等诸多领域。

传统的分子印迹聚合物填料采用本体聚合的方法，过程繁琐、复杂、费时。而整体柱是一种将功能单体、致孔剂、交联剂和引发剂等混合物在管状柱内通过原位聚合制备形成的连续床固定相，具有制备简单快捷、结构均匀稳定、渗透性好、易修饰等优点，被誉为第四代色谱固定相。分子印迹整体柱将分子印迹技术和整体柱技术有机结合，不仅解决了分子印迹聚合物制备繁琐费时的问题，而且提高了整体柱的选择性，有效提高了液相色谱的分离效能，已被应用于医药、生物和环境等领域，是目前分析化学领域的研究热点。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种雷米普利分子印迹整体柱及其制备方法，以及在高效液相色谱分离雷米普利和普利类混合物中的应用，本发明制备方法具有简单、快捷、易操作、易控制等优点。雷米普利化学名称：N-[1(S)-羰乙氧基-3-苯基-丙基]-(S)-丙氨酰基-顺桥-2-氮杂二环[3,3,0]辛烷-3(S)-羧酸，化学结构式：

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种雷米普利分子印迹整体柱，其制备方法为：

将雷米普利(模板分子)、功能单体加入致孔剂和十二醇(溶剂)的混合液中，室温(20～30℃)超声处理20～45min，再加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，交联剂)、偶氮二异丁腈(AIBN，引发剂)，继续于室温下超声处理20～45min至物料溶解，之后通入惰性气体以除去溶解氧，得到反应混合物；将所得反应混合物加到空柱管中，密封柱管两端，置于45～65℃(优选55℃)下进行热引发聚合反应12～36h(优选18h)，制得整体柱，之后经柱冲洗，即得成品。

所述的功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯、苯乙烯中的一种或任意两种以任意比例的组合，优选甲基丙烯酸。

所述的致孔剂为N,N-二甲基甲酰胺、甲苯或环已醇；

所述致孔剂和十二醇的混合液中，致孔剂与十二醇的体积比为1：1.57～6(优选1：4.55)；

所述致孔剂和十二醇的混合液的体积用量为功能单体和乙二醇二甲基丙烯酸酯体积之和的1.74～4.26倍(优选2.68～3.23倍)。

所述的乙二醇二甲基丙烯酸酯与功能单体的体积比为2.1～9：1(优选3.9～5.5：1)。

所述的雷米普利的质量用量以功能单体的体积计为0.24～1.20g/ml(优选0.72～0.95g/ml)。

所述的偶氮二异丁腈的质量用量以功能单体的体积计为0.07～0.28g/ml(优选0.14～0.21g/ml)。

通常，所述的惰性气体为氮气，流速为10ml/L，通气时间5～30min。

所述柱冲洗的方法为：聚合反应完成后，将制得的整体柱依次用甲醇、甲醇-醋酸(体积比8～4：1)混合液和水分别冲洗，以洗去模板分子、致孔剂等，最后再用甲醇-水(体积比10：90～90：10)混合液充分冲洗至基线平稳，即得所述的雷米普利分子印迹整体柱。

更进一步，所述柱冲洗的方法为：

聚合反应完成后，将制得的整体柱连接到高效液相色谱仪上，依次用0.1mL/min甲醇冲洗0.5h、1mL/min甲醇冲洗1h、1mL/min甲醇与醋酸体积比8～4：1的混合液冲洗1h、1mL/min水冲洗1h，以洗去模板分子、致孔剂和溶剂，最后再用甲醇-水(体积比10：90～90：10)混合液冲洗整体柱至基线平稳，即得到所述的雷米普利分子印迹整体柱。

根据本发明方法制备得到的雷米普利分子印迹整体柱可应用于高效液相色谱分离，所述高效液相色谱柱分离模式为反相模式，分离物质为普利类化合物的混合物，所述的普利类化合物例如：卡托普利、雷米普利、苯那普利、喹那普利等。

本发明所述雷米普利分子印迹整体柱的制备方法简单、快捷、易操作、易控制，按照本发明方法制备的雷米普利分子印迹整体柱，可简便、快捷地对普利类混合物进行分离，具有很好的应用前景。

(四)附图说明

图1a为实施例1中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图1b为实施例1中普利类混合试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图2a为实施例2中雷米普利试样在33mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图2b为实施例2中普利类混合试样在33mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图3a为实施例3中雷米普利试样在167mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图3b为实施例3中普利类混合试样在167mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图4为对比实施例4中普利类混合试样在非印迹整体柱中反相模式下色谱图；

图5为实施例5中雷米普利试样在166.6mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图6为实施例6中雷米普利试样在33.3mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图7为实施例7中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图8为实施例8中雷米普利试样在167mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图9为实施例9中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图10为实施例10中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图11a为实施例11中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图11b为实施例11中普利类混合试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图12a为实施例12中雷米普利试样在33mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图12b为实施例12中普利类混合试样在33mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图13a为实施例13中雷米普利试样在133mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图13b为实施例13中普利类混合试样在133mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图14为实施例14中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图15为实施例15中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图；

图16为实施例16中雷米普利试样在100mg模板分子的整体柱中反相模式下色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述，但所述实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比50:50)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例1制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下对雷米普利(1.0mg/ml)试样溶液及雷米普利(1.5mg/ml)、苯那普利(3.0mg/ml)、喹那普利(3.0mg/ml)和卡托普利(0.5mg/ml)混合试样进行分离(用于配制试样的溶剂为水，以下实施例均同)。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1.0ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，成功分离雷米普利试样及四种普利类药物混合试样。所得色谱图如图1a和1b所示，混合试样中各物质的出峰顺序依次为：卡托普利、雷米普利、苯那普利、喹那普利，卡托普利与雷米普利、雷米普利与苯那普利以及苯那普利与喹那普利之间的分离度分别为3.65、1.37、1.19，具有较好的分离效果。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为4000。

实施例2

整体柱制备：

将33mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比50:50)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例2制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下对雷米普利(1.0mg/ml)试样溶液及雷米普利(1.5mg/ml)、苯那普利(3.0mg/ml)、喹那普利(3.0mg/ml)和卡托普利(0.5mg/ml)混合试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH2.5)及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1.0ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，成功分离雷米普利试样及四种普利类药物混合试样。所得色谱图如图2a和2b所示，混合试样中各物质的出峰顺序依次为：卡托普利、雷米普利、苯那普利、喹那普利，卡托普利与雷米普利、雷米普利与苯那普利以及苯那普利与喹那普利之间的分离度分别为2.95、1.14、1.09，具有较好的分离效果。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为2773。

实施例3

整体柱制备：

将167mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比50:50)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例3制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下对雷米普利(1.0mg/ml)试样溶液及雷米普利(1.0mg/ml)和喹那普利(1.0mg/ml)混合试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1.0ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，成功分离雷米普利试样及雷米普利和喹那普利的混合试样。所得色谱图如图3a和3b所示，混合试样中各物质的出峰顺序依次为：雷米普利、喹那普利，且雷米普利和喹那普利的分离度为2.00。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为2120。

对比实施例4

整体柱制备：

不加任何模板分子，将0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比50:50)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到非印迹整体柱。

分离效果测试：

以对比实施例4制备非印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下对雷米普利(1.5mg/ml)、苯那普利(3.0mg/ml)、喹那普利(3.0mg/ml)和卡托普利(0.5mg/ml)混合试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1.0ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，分离四种普利类药物混合试样。所得色谱图如图4所示，出峰顺序依次为：卡托普利、雷米普利、苯那普利、喹那普利，卡托普利与雷米普利、雷米普利与苯那普利以及苯那普利与喹那普利之间的分离度分别为：2.68、1.04、0.86，与实施例1、2、3相比较，分离度明显较差。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1693。

实施例5

整体柱制备：

将166.6mg模板分子雷米普利、0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)和0.05ml苯乙烯溶解在0.53ml N,N-二甲基甲酰胺和2.41ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气10min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比40:60)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例5制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.2)及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图5所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为2560块/米。

实施例6

整体柱制备：

将33.3mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.53ml N,N-二甲基甲酰胺和3.18ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和40mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气30min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比90:10)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例6制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM pH 2.2磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图6所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1666块/米。

实施例7

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.53ml N,N-二甲基甲酰胺和2.41ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入1.25ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和30mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气10min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比10:90)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例7制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)及乙腈混合溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图7所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为2633块/米。

实施例8

整体柱制备：

将167mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.53ml N,N-二甲基甲酰胺和2.41ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.55ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和10mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理20min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气15min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合36h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比20:80)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例8制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM pH 2.5磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图8所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1280块/米。

实施例9

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利、0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)和0.07ml苯乙烯溶解在0.53ml N,N-二甲基甲酰胺和2.41ml十二醇中，室温下超声处理20min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理45min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气15min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合36h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比70:30)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例9制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)和乙腈混合溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图9所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1633块/米。

实施例10

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利、0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)和0.14ml苯乙烯溶解在0.53ml N,N-二甲基甲酰胺和2.41ml十二醇中，室温下超声处理20min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气15min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合36h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比40:60)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例10制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)和乙腈混合溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图10所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为2320块/米。

实施例11

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和30mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比90:10)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例11制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样及雷米普利(1.0mg/ml)、苯那普利(1.0mg/ml)、喹那普利(1.0mg/ml)、卡托普利(1.0mg/ml)混合试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)及乙腈溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为1.0ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，成功分离雷米普利试样及四种普利类药物混合试样。所得色谱图如图11a和11b所示，混合试样中各物质的出峰顺序依次为：卡托普利、雷米普利、苯那普利、喹那普利，且卡托普利与雷米普利、雷米普利与苯那普利以及苯那普利与喹那普利之间的分离度分别为3.26、1.46、1.15，具有较好的分离效果。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为3253块/米。

实施例12

整体柱制备：

将33mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和30mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比30:70)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例12制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样及雷米普利(1.0mg/ml)、苯那普利(1.0mg/ml)、喹那普利(1.0mg/ml)、卡托普利(1.0mg/ml)的混合试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)和乙腈混合溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为0.8ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图12a和12b所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1027块/米。

实施例13

整体柱制备：

将133mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸(MAA)溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和30mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比30:70)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例13制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样及雷米普利(1.0mg/ml)、苯那普利(1.0mg/ml)、喹那普利(1.0mg/ml)、卡托普利(1.0mg/ml)的混合试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)和乙腈混合溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为0.8ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图13a和13b所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1473块/米。

实施例14

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利和0.14ml功能单体甲基丙烯酸丁酯溶解在0.53ml N,N-二甲基甲酰胺和2.41ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和10mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于65℃的恒温箱内进行热引发聚合12h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比70:30)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例14制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)和乙腈混合溶液为流动相，乙腈:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为0.8ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图14所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1307块/米。

实施例15

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利和185mg(相当于0.165ml)功能单体丙烯酰胺溶解在0.44ml甲苯和2.00ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入0.77ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和40mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mm i.d.×150mm)中，两端密封，于45℃的恒温箱内进行热引发聚合30h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比70:30)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例15制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)和甲醇混合溶液为流动相，甲醇:PBS＝20:80(体积比)，流动相流速为0.8ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图15所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1073块/米。

实施例16

整体柱制备：

将100mg模板分子雷米普利和0.53ml功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)溶解在1.10ml甲苯和1.73ml十二醇中，室温下超声处理30min，溶液充分混合后，加入1.13ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和20mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续室温下超声处理30min，使其充分溶解并混合均匀，再通氮气5min，除去溶液中的溶解氧。随后，将此溶液加入到一根不锈钢管(4.6mmi.d.×150mm)中，两端密封，于55℃的恒温箱内进行热引发聚合18h。反应完成后，将其连接到高效液相色谱仪上，先用0.1ml/min甲醇冲洗0.5h，然后再分别用1ml/min的甲醇、甲醇醋酸溶液(体积比8:1)和水分别冲洗1h，洗去模板分子、致孔剂和未反应的溶剂，最后再用甲醇水溶液(体积比55:45)充分冲洗至基线平稳后，即制备得到雷米普利分子印迹整体柱。

分离效果测试：

以实施例16制备的雷米普利分子印迹整体柱为固定相，在反相色谱模式下，对雷米普利(1.0mg/ml)试样进行分离。以20.0mM磷酸二氢钾(PBS)缓冲溶液(pH 2.5)和乙腈混合溶液为流动相，乙腈:PBS＝10:90(体积比)，流动相流速为1.0ml/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长为254nm，所得色谱图如图16所示。

该整体柱在甲醇:水＝85:15的流动相条件下，用萘测得该雷米普利分子印迹整体柱的理论塔板数为1073块/米。