基于裂开型多肽为识别分子的检测方法与流程

本发明涉及基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，具体地说是一种将可以识别目标物的完整肽链裂开为两条多肽作为识别分子检测目标物质含量的方法。

背景技术：

多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽已作为一种高效的识别分子用于对目标物的识别与检测。多肽作为一种优秀的人工受体主要表现在以下几点：1.技术相对成熟；2，成本相对较低；3，易于修饰。与抗体、核酸适体一样，多肽也展示出了对离子、分子、蛋白质、细胞的特异性识别，并且表现出良好的性能。

但是，现有基于多肽为识别分子的传感器多采用竞争性键合，修饰与测定过程较为复杂，难以用于“夹心法”反应，应用范围较窄，采用裂开型多肽为识别分子可以对两段肽链分别修饰，实现对目标物的一步识别并检测，极大的扩大了多肽在传感器领域的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于裂开型多肽为识别分子的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于“裂开型”多肽为识别分子的检测方法，以“裂开型”两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b作为识别分子，将识别分子与待测目标物特异性识别形成三维结构，形成夹心模式进而实现对待测目标物的定量检测。

所述“裂开型”两条短肽的整体为至少包括10个氨基酸的肽链；其中，“裂开”位点应在整条肽链的中心三分之一至三分之二处。

所述两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b两端分别修饰，并应用于“夹心法”传感器。

所述短肽a的c端(或n端)通过共价键或亲和反应进行修饰；所述短肽b的n端(或c端)通过荧光标记、共价修饰酶或共价键进行修饰。

所述“裂开型”两条短肽的整体肽为对离子、小分子、多糖、蛋白质或细菌可识别的多肽；所述目标物质为离子、小分子、多糖、蛋白质或细菌。

所述“裂开型”两条能够特异性识别待测目标物的短肽a和b序列分别为a、gvhrlangk与b、nwgeafsa，a’、fsagvhrlangk与b’、biotin-nwgea或a”、rlangk、；b”、nwgeafsagvh；进而特异性识别单增李斯特菌。上述，“裂开型”多肽包括将完整的肽链在适当位点分裂后形成的片段a和片段b，二者与目标物会发生特异性结合。所述的完整的肽链具有对目标物的特异性识别能力；所述的适当位点是指在该位点对完整的肽链进行分裂后的多肽仍能保持对目标物的特异性识别能力；所述的片段a和片段b在没有目标物存在时不会发生相互作用，当目标物存在时，片段a和片段b与目标物发生特异性结合。片段a的c端(或n端)可以通过共价键修饰在电极表面，或者通过亲和反应修饰于磁珠、磁纳米颗粒上，达到固定的或者分离的目的。片段b的n端(或c端)可以进行荧光标记、共价修饰酶以及共价修饰电化学活性基团，达到对目标物进行识别的目的。目标物存在时，裂开的两条肽链与目标物结合形成特殊的三维结构。片段b上的活性物质可以直接或间接的引起电化学信号、荧光信号的改变，信号改变的大小与目标物的浓度是成比例的，进而实现对目标物浓度的测定。

所述共价键修饰在电极表面为通过酰胺键、金－硫键修饰在电极表面。

所述电极为玻碳电极、石墨电极、金属电极、ito导电玻璃电极、丝网印刷电极或纸芯片电极。

所述亲和反应为将生物素、亲和素分别修饰于肽链和磁珠(或磁纳米颗粒)上，生物素和亲和素发生亲和反应，将肽链连接在磁珠(或磁纳米颗粒)上。

所述荧光标记为将fitc、fam、罗丹明、afc、amc、rox、sulforhodamine101、5‐tamra、edanstexasred标记在肽链上或者将肽链进行量子点标记、金纳米标记；共价修饰酶为将过氧化氢酶、磷酸酯酶修饰在肽链上；共价修饰电化学活性基团为修饰二茂铁在肽链上。

所述电化学信号指氧化还原物质在电极表面产生的电流信号或电活性物质在离子选择性膜上产生的电位响应；荧光信号为荧光标记物质在荧光检测器上信号的改变。

本发明检测原理为：片段a或者片段b不能单独识别目标物，片段a与片段b同时存在时才可以识别目标物并折叠成螺旋结构，片段a与片段b的两端可以修饰不同的标记物来扩大该方法的适用性。依本发明方法的检测原理应用的主要模式包括“夹心”反应模式、竞争性键合反应模式。

本发明优点在于：

1.本发明提出的裂开型多肽易于合成，而且保留了对目标物的选择性识别性能。

2.本发明利用裂开型多肽可以对目标物进行选择性识别，裂开的两段肽链可以分别作为捕获与信号探针，只有在目标物存在时，两段探针同时作用于目标物，可以达到筛选并检测的目的。

3.本发明可应用于多种检测方法。凭借多肽易标记的特点，可以对多肽进行固定、修饰，而且不会对多肽的识别性能产生影响，可以用于多种检测装置，这极大的拓展了多肽在传感器领域的应用。

附图说明

图1为本发明实施例中裂开型多肽为识别分子的电位传感器检测单增李斯特菌的原理示意图。

图2为本发明实施例1中电极对过氧化氢酶催化tmb产物响应的标准曲线图。

图3为本发明实施例2中荧光检测fitc标记的识别李斯特菌的多肽标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。

具体为对裂开型多肽进行固定或者标记，在目标物存在时，裂开型的两条多肽与目标物质相互作用，形成复合物，并通过多肽上的荧光物质、酶直接或者间接地得到光电信号，不同浓度的目标物引起的电信号不同，从而实现对目标物的检测。本发明提出的裂开型多肽对目标物具有良好的选择性识别性能，并且可以用做多种传感器的主要组成部分，有重要的科学价值和广阔的市场前景。

实施例1

基于裂开型多肽为识别分子的电位传感器检测单增李斯特菌。其测定步骤如下：

1)以肽链geafsagvhrlang作为识别单增李斯特菌的完整肽链，由于其识别过程会形成三维结构，将此肽链裂开成a、b两条肽链后，其识别过程仍可能形成三维螺旋结构与目标物相互作用。分别合成两条肽链，为增加肽链的亲水性、易于对肽链进行修饰，在两端增加了不同的氨基酸。然后对两条肽链修饰生物素。其序列为：a，gvhrlangk-biotin；b，biotin-nwgeafsa。为验证不同位点对识别的影响，又分别合成了四条由不同位点裂开的肽链a’，fsagvhrlangk-biotin；b’，biotin-nwgea；a”，rlangk-biotin；b”，biotin-nwgeafsagvh。

2)如图1所示，将肽链a，a’，a”通过亲和反应连接在磁珠上，肽链b，b’，b”通过亲和反应连接辣根过氧化氢酶(hrp)。肽链a，a’，a”，b，b’，b”的浓度均为10^-3m，磁珠100微升，辣根过氧化物酶的浓度为1u/ml。

3)如图1所示，将上述浓度的肽链a、b、肽链a’、b’或肽链a”、b”分别与不同浓度的单增李斯特菌同时加入烧杯中，两条肽链与单增李斯特菌发生特异性结合，静置1小时以使其能反应完全。使用磁铁对磁珠进行分离，分离后的磁珠通过肽链连接了单增李斯特菌，并且在肽链b上连接了hrp酶，将反应后的溶液使用移液枪移走。

4)电极制作。电极膜组成为：171mg聚氯乙烯，171mg邻-硝基苯辛醚，10mm/kg四苯基硼酸钠。称取电极膜组分并溶于3ml四氢呋喃溶液中，于恒温恒湿箱中静置12小时，待四氢呋喃挥发后形成有弹性的电极膜。将电极膜切成圆形并粘于pvc管上做成简易的工作电极。电极使用之前在15mm氯化钠溶液中进行活化，测试溶液为50mm，ph为7.4的磷酸缓冲溶液。ag/agcl电极为参比电极，组成两电极体系用于后续测定。

5)电极测定。在电化学池中加入2ml磷酸缓冲溶液，依次加入0.1mmtmb，0.5mmh2o2，最后加上前面分离出的多肽与菌的复合物。复合物上修饰的过氧化氢酶催化可以催化溶液中的tmb，其中间产物可以在前面制作的电极上产生电位变化。

6)不同裂开位点影响。将a’，b’两条肽链和a”，b”两条肽链按照上述方法分别用于对李斯特菌的测定。实验结果表明，a、b两条肽链对李斯特菌的识别效果最好，所以采用a、b肽链进行后续的测定。

7)作标准曲线。使用a、b两条肽链对不同浓度的李斯特菌进行测定，连接的hrp酶的浓度不同，导致电位变化不同，从而作出标准曲线(如图2)。实施例2

基于裂开型多肽为识别分子的荧光检测单增李斯特菌

与实施例1不同之处在于：

1)肽链b通过共价键标记荧光标记物fitc，其序列为fitc-nwgeafsa。

2)将10^-3m肽链a，b与不同浓度的单增李斯特菌相互作用后，利用磁珠的磁性对复合物进行分离，将多余的荧光标记的肽链b去除。

3)在荧光检测器上检测复合物的荧光强度，并作出标准曲线(如图3)。实施例3

基于裂开型多肽为识别分子的电化学检测单增李斯特菌

与实施例1不同之处在于：

1)肽链a通过增加半胱氨酸修饰上巯基，并依靠金-硫键固定在电极上，肽链b通过共价键修饰二茂铁。

2)将电极插入到含有肽链b以及不同浓度的李斯特菌的溶液中，两条肽链与李斯特菌发生特异性结合。

3)电极测定。进行差分脉冲伏安法检测，李斯特菌连接的二茂铁在电极上产生电化学信号，只有通过李斯特连接的肽链b上的二茂铁会在电极上发生反应，根据不同浓度的李斯特菌产生不同的电化学信号作出标准曲线。

实施例4

基于裂开型多肽为识别分子的纳米金比色法检测单增李斯特菌

与实施例1不同之处在于：

1)肽链a和肽链b均通过增加半胱氨酸来修饰巯基，并通过金-硫键修饰金纳米颗粒。

2)李斯特菌不存在时，纳米金以分散状态存在；加入李斯特菌时，纳米金上的肽链识别并连接到李斯特菌上，造成纳米金的富集，引起颜色变化。

3)不同深度的李斯特菌，引起纳米金的富集程度不同，颜色变化出现区别，以此达到检测李斯特菌的目的。

实施例5

量子点标记裂开型多肽测定单增李斯特菌

与实施例1不同之处在于：

1)肽链b的n端通过酰胺键修饰cds量子点。

2)肽链a，b与李斯特菌同时存在时，“裂开型”多肽识别李斯特菌形成复合物，磁珠分离复合物并使用过氧化氢催化cds量子点，得cd²⁺。不同浓度的李斯特菌连接的肽链b的浓度不同，因此分离出的cds量子点的量不同。

3)使用铬离子选择性电极对cd²⁺的浓度进行电位测定，间接得出李斯特菌的浓度，作出标准曲线。

实施例6

基于高通量elisa反应测定李斯特菌

与实施例1不同之处在于：

1)肽链a通过化学吸附固定于96微孔板中。

2)将李斯特菌与修饰了过氧化氢酶的肽链b同时加入到微孔板中，进行反应。1小时，反应完全，使用清水洗脱，并加入上述浓度的的tmb，h2o2，发生显色反应。

3)不同浓度的李斯特菌引起的颜色变化程度不同，通过比色反应得出李斯特菌的浓度。

4)此方法可以实现单增李斯特菌的高通量分析。

实施例7

基于裂开型多肽为识别分子的电位传感器检测脂多糖。其测定步骤如下：

与实施例1不同之处在于：

1)待测定的目标物为脂多糖(细菌内毒素)的检测。

2)完整肽链为kknysssissihc，为方便对肽链进行修饰，在肽链a的一端增加了一个氨基酸，合成的肽链分别为a，issihck-biotin；b，biotin-kknysss。

3)利用实施例1中的方法对脂多糖进行检测。当脂多糖的浓度增加时，电位信号变化增大，通过不同浓度脂多糖引起的电位变化不同作出标准曲线，完成对脂多糖的定量分析。

4)由上述标准曲线可见“裂开型”两条短肽能有效的定量检测脂多糖，完成对其的电位检测。

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<110>中国科学院烟台海岸带研究所

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