用于有机磷农药检测的乙酰胆碱酯酶生物传感器及其制备方法与流程

本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器及其制备方法，该生物传感器用于快速测定有机磷农药，属于分析技术领域。

背景技术：

随着现代农业的发展，越来越多的农药被用于农业生产，其中有机磷(OPs)农药是目前使用最为广泛的品种，其高毒性和高残留性直接危害了人民健康。因此，建立快速、灵敏的OPs检测方法显得非常必要。

我国现行OPs农药国家标准主要检测方法为色谱法。色谱法定量准确,但仪器体积庞大,样品前处理过程繁琐，对检测人员的技术要求高，而且不适合现场快速检测。

近年来基于乙酰胆碱酯酶(AChE)的电化学生物传感器已在有机磷农药残留检测方面得到了很好的应用，相对于传统的色谱法，电化学生物传感器具有简单、快速、实用、可靠、灵敏等优点。但是到目前为止，AChE生物传感器仍存在灵敏度低和稳定性差等方面的问题，研制高灵敏及稳定性好的AChE生物传感器仍值得探索。对于AChE生物传感器,固定AChE的数量直接影响传感器的灵敏度。因此,开发新型的AChE固定材料,增加AChE的负载量,是提高AChE传感器灵敏度的关键。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种负载量高、灵敏度高的新型乙酰胆碱酯酶生物传感器，实现有机磷农药的快速高效检测。另一目的在于提供其制备方法。

为实现本发明目的，技术方案如下：

该乙酰胆碱酯酶生物传感器通过以下方法制备而成：

(1)氨基功能化离子液体1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL-NH₂)的合成

3-溴丙胺氢溴酸盐和N-甲基咪唑混合，以无水乙醇作为溶剂，氮气保护，回流反应，旋蒸除去溶剂，适量乙醚超声洗涤，调节pH值在8-9，旋蒸除去水制得1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑溴盐，然后和四氟硼酸钠发生离子交换制得1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。

3-溴丙胺氢溴酸盐和N-甲基咪唑摩尔比：1:1。

(2)离子液体功能化石墨烯(IL-GR)的合成

石墨粉缓缓地加入浓硫酸中，搅拌反应，冰水浴条件下，搅拌状态下慢慢加入KMnO₄，控制温度在35-40℃，恒温反应。反应后将其加入蒸馏水中，搅拌下加入H₂O₂，反应结束后，洗涤产物，干燥，得到石墨烯氧化物(GO)。

将GO、1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和KOH混合，80-90℃搅拌反应，尔后加入NaBH₄溶液得到离子液体功能化石墨烯(IL-GR)。

石墨粉、浓硫酸、KMnO₄、H₂O₂摩尔比：4:18:1.2:4。

GO、1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和KOH的摩尔比范围：3.3:2.5:3.6。

(3)GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器制备

将IL-GR超声分散于明胶溶液中制备IL-GR-Gel分散液。玻碳电极(GCE)抛光后用丙酮、无水乙醇依次超声洗涤后晾干。将IL-GR-Gel分散液与乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液(V/V，2-3:1)混合后滴加在处理过的玻碳电极表面，将其置于4-5℃冰箱中干燥。然后将电极浸入戊二醛(GA)溶液中交联，即得GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器。

IL-GR与明胶重量比：2:5。

测试方法

采用差分脉冲伏安法(DPV)检测有机磷农药。对含1.0mmol/L氯化乙酰胆碱(ATCl)的0.1mol/L(pH 7.0)的PBS溶液进行DPV扫描，确定传感器的原始响应电流(I₀)。然后将其置于不同浓度的农药溶液中浸泡5min，相同条件下测定传感器在ATCl中的响应电流(I₁)。根据前后电流的变化计算抑制率(I％)，根据I％与有机磷农药浓度的对数关系建立工作曲线。抑制率计算公式如下：

I％＝[(I₀－I₁)/I₀]×100％

实际样品的检测

购买的实际样品处理后，取一定量样品喷洒不同浓度的有机磷农药。将每个样品用丙酮浸泡，4-5℃过夜并过滤，残余物用丙酮洗涤，并将洗涤液与滤液合并定容至容量瓶中制备样品溶液。先测定传感器在含1.0mmol/L ATCl的0.1mol/L(pH 7.0)的PBS溶液中的原始响应电流(I₀)，再测定在上述溶液中加入一定量的样品后传感器的响应电流，根据上述公式计算抑制率(I％)。样品中农药的浓度根据其抑制率，通过获得的标准曲线求得。

本发明的测定原理如下：加入到电解池的底物氯化乙酰胆碱受固定在电极表面的乙酰胆碱脂酶催化水解，形成胆碱和乙酸。胆碱在相应电位下氧化产生氧化电流。加入有机磷后，乙酰胆碱脂酶的催化活性降低，水解反应受到抑制，减少了反应产物，导致胆碱氧化电流的减小，而氧化电流的减少量能准确的反映出乙酰胆碱脂酶被抑制的程度，根据前后电流的变化计算抑制率(I％)，根据I％与有机磷农药浓度的关系建立的标准工作曲线，从而检测出有机磷的浓度。

本发明创新点在于：利用离子液体功能化石墨烯和明胶的优良特性，将离子液体功能化石墨烯(IL-GR)用于乙酰胆碱酯酶(AChE)的固定，利用明胶可为酶固定提供自然的微环境，良好的生物相容性和成膜能力，制备了新型复合膜IL-GR-Gel修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器。实现了有机磷农药的高灵敏检测。该方法克服了现有的有机磷测定方法速度慢，成本高，操作繁琐的缺点，提供了一种简单，快速，灵敏度高的有机磷农药测定方法。

本发明优点在于：一、不需要样品的预处理，节约了时间；二、使用价格相对低廉的离子液体功能化石墨烯和明胶固定乙酰胆碱酯酶构制新型传感器，节约了成本；三、检测结果的灵敏度很高，最低检测浓度为5.0×10^-14mol/L。可用于低含量样品的检测。四、乙酰胆碱酯酶负载量高，达0.25U。

附图说明

图1为本发明AChE生物传感器构制原理图。

图2为本发明AChE生物传感器对氯化乙酰胆碱抑制率与有机磷农药浓度的对数关系建立的工作曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做详细说明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

1、材料与试剂

CHI-660E电化学工作站 上海辰华仪器有限公司

氯化乙酰胆碱(ATCl)，乙酰胆碱酯酶(AChE，C 3389，236U/mg)和戊二醛(GA，25％)，Sigma–Aldrich(St.Louis，USA)生产

久效磷(97.4％) 北京上立方联合化工技术研究院生产

化学试剂：均为分析纯

2、试剂的配制：

2.1 0.1mol/L的磷酸盐(PBS)缓冲液：由0.1mol/L磷酸二氢钠和0.1mol/L磷酸氢二钠按照一定的体积比混合而成。

2.2 1.0×10^-2mol/L氯化乙酰胆碱溶液：0.1817克氯化乙酰胆碱使用0.1mol/L PBS(pH＝7.5)定容至100ml容量瓶。

2.3乙酰胆碱酯酶溶液：购买的纯品使用0.1mol/L PBS(pH＝7.5)溶液稀释使用。

2.4 1.0×10^-3mol/L久效磷溶液：0.02232克久效磷用少量丙酮溶解后，蒸馏水定容在100ml容量瓶。

3、制备方法

(1)氨基功能化离子液体1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL-NH₂)的合成

25mL圆底烧瓶中加入1g 3-溴丙胺氢溴酸盐和0.36mL N-甲基咪唑，再加入10mL无水乙醇作为溶剂，充分溶解之后加氮气保护，在油浴锅中缓慢升温至80℃，回流反应24h。反应结束后，45℃旋蒸除去溶剂，瓶底的淡黄色油状物即为粗产品，加入适量乙醚超声洗涤3次，倾去乙醚，将淡黄色油状物用适量水溶解，加入少量KOH(4mol/L)调节pH值在8左右，用于保护生成的氨基，65℃旋蒸除去水，加入乙醇-四氢呋喃(5mL，V/V，1:1)并过滤，将过滤之后收集的滤液45℃旋蒸后使用乙醚多洗涤几次，倾去乙醚，常温旋蒸除去残留乙醚，即制得1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑溴盐。紧接着在25mL圆底烧瓶中加入1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑溴盐(0.3g)和四氟硼酸钠饱和溶液(0.25g)，溶解在无水乙醇中(10mL)，并将混合物在室温下搅拌12小时，过滤后滤液用二氯甲烷萃取2次，将二氯甲烷相用无水MgSO₄进行干燥2～3h，并重复一次，使用AgNO₃检测无白色沉淀产物，证明二氯甲烷相中不含Br，45℃旋蒸除去二氯甲烷，使用乙醚多洗涤几次，倾去乙醚，常温旋蒸除去残留乙醚，50℃真空干燥得到离子液体1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。

(2)离子液体功能化石墨烯(IL-GR)的合成

5g石墨粉缓缓地加入到100mL浓硫酸中，搅拌反应12h。反应结束后，搅拌状态下慢慢加入20g KMnO₄，冰水浴中反应2h后移入油浴，控制温度在35℃，恒温反应24h。结束后将产物倒入700mL二次蒸馏水中，搅拌下加入40mLH₂O₂，此时可观察到液体为棕黄色。质量百分比5％的盐酸和蒸馏水洗涤产物，60℃后干燥24h，得到石墨氧化物(GO)。

40mg GO，500mg 1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和200mg的KOH加入至200mL蒸馏水中超声处理30分钟，形成均匀的混合物。将所得到的混合物80℃搅拌24小时。然后加入40mL 1.0mol/L NaBH₄溶液用来还原石墨氧化物，80℃反应3h。离心分离进行收集，用乙醇和水充分洗涤以除去杂质。将所得的IL-GR纳米片在60℃真空下干燥过夜。

(3)GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器制备

IL-GR(4mg)超声分散于1％(wt％)明胶溶液(1mL)中制备IL-GR-Gel分散液。玻碳电极(GCE)抛光后用丙酮、无水乙醇依次超声洗涤后晾干。将IL-GR-Gel分散液与乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液(V/V，2:1)混合的分散液6μL滴加在处理过的玻碳电极表面，将其置于4℃冰箱中干燥12h。然后将电极浸入质量百分比3％戊二醛(GA)溶液中交联20min，制备得到GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE，放在4℃冰箱中待用。传感器的制备过程如图1所示。乙酰胆碱酯酶负载量为0.25U。

应用例1

1、测试方法

采用差分脉冲伏安法(DPV)检测久效磷。在含1.0mmol/L ATCl的0.1mol/L(pH 7.0)的PBS溶液中，在0.2～1.0V之间进行DPV扫描，记录DPV曲线，0.6V下确定传感器的原始响应电流(I₀)。然后将其置于不同浓度的农药溶液中浸泡5min，相同条件下测定传感器在底物氯化乙酰胆碱(ATCl)中的响应电流(I₁)。根据前后电流的变化计算抑制率(I％)，根据I％与有机磷农药浓度的对数关系建立工作曲线，见附图2。抑制率计算公式如下：

I％＝[(I₀－I₁)/I₀]×100％

2、实际样品的检测

从超市购买的卷心菜洗净并研碎，然后将10g卷心菜样品分别喷洒上2.0×10^-11、8.0×10^-11、2.0×10^-10、8.0×10^-10、2.0×10^-9、8.0×10^-9mol/L不同浓度的久效磷。将每个样品用10mL丙酮浸泡，并在4℃过夜。然后将混合物过滤，将残余物用20mL丙酮洗涤，并将洗涤液与滤液合并定容至50mL容量瓶中制备样品溶液。先测定传感器在含1.0mmol/L ATCl的0.1mol/L(pH 7.0)的PBS溶液中的原始响应电流(I₀)，再测定在上述溶液中加入一定量的样品溶液后传感器的响应电流，根据上述公式计算抑制率(I％)。抑制率分别为38.4％，44.5％，48.9％，55.6％，59.2％，65.8％，样品中农药的浓度根据获得的标准曲线附图2求得。

3、回收率试验

为了考察本发明GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器在实际样品检测中的可行性，本专利对卷心菜中的久效磷进行了加标回收测定。测定结果见表1

表1

实验表明，本专利对于卷心菜中的久效磷检测，平均回收率在93.7～106.2％之间，测定的相对标准偏差(RSD)在2.6～4.2％之间。研究结果表明本发明乙酰胆碱酯酶生物传感器对于低含量有机磷农药的检测的精密度和准确度均较好，可用于真实环境中实际样品的分析。