二联定性真菌毒素胶体金免疫层析试纸条及制备方法与流程

文档序号:11913396阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种二联定性真菌毒素胶体金免疫层析试纸条,包括作为基材的黑色长条状聚氯乙烯背板,其特征在于,在沿背板长度方向在其表面依次布置样品垫、胶体金抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫,相邻垫或膜间彼此搭接;在硝酸纤维素膜上,设有与背板同宽的彼此间隔的两条检测线和一条质控线,其中质控线位于两条检测线之间;

在胶体金抗体标记物固定垫上,以喷涂、敷涂或浸泡的方式固定有真菌毒素单克隆抗体、兔多克隆抗体的胶体金标记复合物;所述质控线是将山羊抗兔多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成,所述检测线是将待检真菌毒素偶联抗原喷涂于硝酸纤维素膜上形成,两条检测线所含真菌毒素偶联抗原是不同的。

2.根据权利要求1所述的二联胶体金免疫层析试纸条,其特征在于,所述真菌毒素单克隆抗体所对应的真菌毒素,是赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1或呕吐毒素中的任意一种。

3.根据权利要求1至2任意一项中所述的胶体金免疫层析试纸条,其特征在于,该试纸条的宽度为0.4cm,样品垫、胶体金抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫的长度分别为1.7cm、0.8cm、2.5cm、1.7cm;其中,样品垫与胶体金抗体标记物固定垫的搭接重合长度为0.2cm,胶体金抗体标记物固定垫与硝酸纤维素膜的搭接重合长度为0.2cm,硝酸纤维素膜与吸收垫的搭接重合长度为0.3cm;在硝酸纤维素膜上,两条检测线及第二检测线与质控线之间的间距分别为0.4cm、0.4cm,并且质控线位于两条检测线之间。

4.制备权利要求1所述二联胶体金免疫层析试纸条的方法,其特征在于,包括下述步骤:

(1)制备胶体金抗体标记物固定垫

取真菌毒素特异性单克隆抗体、兔多克隆抗体的胶体金标记复合物,在4℃放置,备用;

以喷涂、敷涂或浸泡的方式,将胶体金-真菌毒素特异性单克隆抗体、兔多克隆抗体的标记复合物固定在胶体金抗体标记物固定垫上,在37℃干燥2小时备用;

(2)检测线与质控线的喷涂:取硝酸纤维素膜贴于作为基材的长条状聚氯乙烯背板上,点膜仪在硝酸纤维素膜上同时喷涂两条检测线和一条质控线,其中质控线位于两条检测线之间;质控线的喷涂液为山羊抗兔多克隆抗体,两条检测线的喷涂液是不同种类的待检真菌毒素偶联抗原;在37℃干燥2小时后,置于聚乙二醇溶液中浸泡30分钟后晾干后在37℃干燥2小时备用;

(3)免疫层析试纸条的组装:将样品垫、胶体金抗体标记物固定垫和吸收垫布置于聚氯乙烯背板上,并使样品垫、胶体金抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次排列,硝酸纤维素膜的质控线位于吸水垫一侧,且相邻垫或膜间彼此搭接;将聚氯乙烯背板及其贴附的材料切成4mm宽的层析条,将层析条放入塑料板卡内,用压卡机压实。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述真菌毒素特异性单克隆抗体、兔多克隆抗体的胶体金标记复合物,是通过下述方法制备获得的:

使用0.2M K2CO3调节胶体金溶液pH,取50mL边搅拌边迅速加入10mM Tris-HCl溶液(pH7.4)稀释的待标记抗体50μg,室温混匀作用30min后加入BSA蛋白溶液封闭,终浓度为1%,充分混匀作用30min后,2000×g 4℃离心20min,弃沉淀;上清以8000×g 4℃离心30min后弃上清;使用10mL 2mM并含有1%BSA的硼酸盐缓冲液(pH7.4)重悬后,以8000×g离心20min,洗涤未结合抗体;重复洗涤两次,弃上清,沉淀用5mL硼酸盐缓冲液重悬后分装,置于4℃保存备用;采用免疫层析法对制备的金标抗体进行鉴定,即将真菌毒素偶联抗原、羊抗鼠和羊抗兔二抗分别划线于NC膜上,组装成简易的层析系统,将制备的金标抗体点在样品垫上,观察是否形成红色条带,判断是否标记成功且有无抗体活性。

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