一种用于农药检测的适配体传感器的制备方法与流程

本发明涉及一种用于检测农药的适配体传感器的制备方法，属于农产品安全检测技术领域。

技术背景

随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其果品、蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点，常用农药如毒死蜱、对硫磷、丙溴磷等具有一定的内吸性，可以通过食物链的富集作用转移至人体，对人体具有潜在致癌作用，因此，农药一直是环境和食品安全检测的重要项目，加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义。

常用的农药残留快速检测方法有酶抑制法和免疫传感器法，可以实现有机磷农药的现场快速检测，具有较好的实用价值，然而，酶抑制法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点，免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理所研制的传感器，但是所用生物敏感物质抗体获取比较昂贵，处理环境比较苛刻，与传统的免疫分析方法相比，适配体传感器具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点，适配体传感器的敏感界面是固定适配体到电极的表面，其直接影响适配体传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、选择性好的检测农药残留的适配体传感器制备方法，采取的技术方案为：

所述一种检测农药的适配体传感器的制备，其特征在于，适配体传感器的传感界面组成包括导电炭黑-壳聚糖、氧化石墨烯复合四氧化三铁纳米复合物，进而固定农药的核酸适配体，最后用牛血清蛋白即BSA封闭，得到检测农药的适配体传感器。

所述方法的步骤如下：

1) 清洗、活化并测试裸玻碳电极，获得预处理玻碳电极；

2) 制备炭黑-壳聚糖复合液，滴涂到步骤1)的预处理玻碳电极上；

3) 制备氧化石墨烯-四氧化三铁复合纳米材料，并用壳聚糖溶液进行分散，将此分散液滴涂到在步骤2)所得的修饰电极上；

4) 在步骤3)所得的修饰电极上固定农药适配体；

5) 用牛血清蛋白封闭步骤4)所得的电极，得到适配体生物传感器。

根据步骤1)所述清洗、活化并测试裸玻碳电极是利用热 piranha 溶液浸泡裸玻碳电极后，用Al₂O₃浆抛光，再依次用去离子水、HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测裸电极循环伏安曲线峰电位差测试电极。

根据步骤2)所述在预处理电极表面分层滴涂导电炭黑-壳聚糖溶液，是先将0.25 g 壳聚糖溶解于50 mL 乙酸溶液中持续搅拌至完全分散得到壳聚糖溶液，再将1.0 mg 导电炭黑加入到1.0 mL 上述壳聚糖溶液中超声分离50 min得到导电炭黑-壳聚糖溶液，取7 μL的炭黑-壳聚糖溶液滴涂在预处理玻碳电极上，在空气中干燥，用超纯水冲洗表面，将未固定在电极表面的液体冲洗掉，得到炭黑-壳聚糖修饰的玻碳电极。

根据步骤3)所述在电极表面滴涂氧化石墨烯-四氧化三铁复合纳米材料，是先采用 Hummers 方法制备氧化石墨烯，再利用热溶剂法制备氧化石墨烯-四氧化三铁复合物，将7 μL的氧化石墨烯-四氧化三铁复合纳米材料滴涂在电极上，在空气中干燥，得到氧化石墨烯-四氧化三铁复合物修饰的电极。

根据步骤4)所述在工作电极上滴涂农药适配体，是将步骤3)所得电极浸入20 μL的2.5 μM适配体溶液中，并在4 ℃下静置12 h，之后用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未吸附上的适配体，得到适配体修饰的电极。

根据步骤5)所述用牛血清蛋白封闭固定电极，是指将固定电极浸入0.5%的BSA溶液中26 ℃下静置2 h。

所述方法的具体步骤如下：

1)利用热Piranha溶液浸泡裸玻碳电极后，用Al₂O₃浆抛光，再依次用去离子水、HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测裸电极循环伏安曲线峰电位差测试电极，得到预处理电极；

2)在50 mL 1.0% 乙酸溶液中加入0.25 g壳聚糖，配制成0.5% 壳聚糖溶液，将1.0 mg导电炭黑加入到1.0 mL新配制的0.5% 壳聚糖溶液中，通过超声处理直到均匀分散，将制备好的炭黑-壳聚糖复合物在4 ℃下存储；

3)采用Hummers方法制备氧化石墨烯，再利用热溶剂法制备氧化石墨烯-四氧化三铁复合物，将40 mg氧化石墨烯加入到30 mL 乙二醇中，再分别加入3 g 氯化铁，9 g 醋酸钠和30 mL 乙二胺(EDA)，超声分散得到均匀溶液，然后回流加热8 h，经过离心分离后水洗数次，真空干燥得到氧化石墨烯-四氧化三铁复合物；

4)将7 μL的步骤2)制备的导电炭黑-壳聚糖复合物滴涂在步骤1)所得的预处理玻碳电极上，在空气中干燥，用超纯水冲洗表面，将未固定在电极表面的复合物冲洗掉，得到导电炭黑-壳聚糖修饰的电极；

5)滴涂7 μL的步骤3)制得的氧化石墨烯-四氧化三铁复合纳米材料滴涂到步骤4)所得修饰电极的表面上，在空气中干燥，用超纯水冲洗表面，将未固定在电极表面的复合物冲洗掉，得到氧化石墨烯-四氧化三铁复合修饰的电极；

6)将步骤5)得到的电极浸入20 μL的2.5 μM农药适配体溶液中并在4 ℃下静置12 h，之后用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未吸附上的适配体，得到适配体修饰的电极；

7)将步骤6)所得固定电极浸入0.5%的BSA溶液中26 ℃下静置2 h。

所述一种检农药的适配体传感器的制备，其特征在于：适配体传感器的敏感界面组成包括导电炭黑-壳聚糖复合膜和氧化石墨烯-四氧化三铁复合物，然后固定适配体。

所述一种检测农药的适配体传感器的制备，其特征在于：玻碳电极(d=3 mm)的清洗，传感器传感界面的构建及过程表征(制备炭黑-壳聚糖、氧化石墨烯复合四氧化三铁纳米复合材料并以壳聚糖作为分散剂进行分散，利用纳米材料的协同作用共同修饰电极)，适配体传感器工作曲线的建立，适配体传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。

所述一种检测农药的适配体传感器的制备，其特征在于：实验条件的优化，主要包括测试底液pH和孵育时间；所制备的适配体传感器的工作曲线为：ΔI=14.82×logC+13.26 (ng/mL) (R²=0.993，0.1-10⁵ ng/mL)；适配体传感器性能检测包括特异性、重现性、稳定性、再生性以及适配体传感器对蔬菜样品回收率的测定。

其制备原理为：适配体传感器以适配体作为识别元件，通过固定化技术将适配体结合到感受器表面，发生特异性识别反应后，生成的复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，再经过二次仪表放大并且输出信号，从而实现对待测物质的检测，本发明采用以壳聚糖作为分散剂制备的导电炭黑和氧化石墨烯复合四氧化三铁纳米复合物对玻碳电极进行修饰，氧化石墨烯复合四氧化三铁纳米材料，通过传统的溶剂热方法在通过加热、回流、提纯、清洗、干燥等步骤制备。导电炭黑是一种典型的特种炭黑，因其良好的导电性能和较高的性价比，广泛应用于导电和防静电制品中，氧化石墨稀(graphene oxide, GO)作为石墨稀的衍生物，为氧化石墨的剥落物，可用强质子酸处理原始石墨，再进行氧化生成氧化石墨，氧化石墨稀价格便宜，容易制得，同时它具有较好的亲水性和较低的生物毒性，因此在生物医学、生物分析、以及生物传感等领域具有潜在的应用价值，壳聚糖(CS)属于多糖类，它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备，壳聚糖的良好的生物相容性，可作为适配体的固定载体，为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，保持了适配体的生物活性以用来和农药进行有效的特异性结合，采用本发明制成的适配体传感器可以在蔬果采收、上市前进行农药残留的快速测定，直接对农药残留量是否超标进行检测，避免因食用含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药的适配体传感器的制备，其特征在于：(1) 适配体传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在100 mV以下，氧化峰和还原峰对称，则所述玻碳电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求；(2) 清洗好的裸玻碳电极表面滴涂分散均匀的炭黑-壳聚糖复合液，继而修饰氧化石墨烯-四氧化三铁复合物，然后固定适配体，最后用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点，适配体传感器制备结束后，放入冰箱里4 ℃保存备用。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药的适配体传感器的制备，其特征在于：(1) 将上述制备好的适配体传感器在工作底液中以不同的扫速做循环伏安方法扫描，可以得到峰值和扫速的关系，得到是受扩散控制的；(2) 配置一系列的农药标准液，进行循环伏安扫描，得到抑制率，进一步得出上述制备的适配体传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(3) 配置一系列经常混合使用的农药溶液，以检测所制备的适配体传感器的特异性；(4)通过循环伏安扫描多段并且于冰箱中放置一段时间再次测量验证上述适配体传感器的稳定性，通过解离和再次免疫检测其再生性能；(5) 对实际果蔬样品进行分析得出该适配体传感器的回收率。

本发明使用的氧化石墨烯是用强质子酸处理原始石墨，再进行氧化生成氧化石墨，然后采用传统的溶剂热方法经过加热、回流、提纯、清洗、干燥等步骤制备制备氧化石墨烯-四氧化三铁纳米复合材料，再以具有良好生物相容性和成膜性的壳聚糖作为分散剂进行分散，得到的纳米复合物膜能够促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，用以制备响应信号强和灵敏度高的适配体传感器。

所述适配体传感器的制备工艺如下：(1) 取7 µL分散均匀的导电炭黑-壳聚糖纳米复合膜滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温下静置3 h，用pH7.5的PBS冲洗电极表面；(2) 电极表面晾干后，取7 µL氧化石墨烯-四氧化三铁纳米复合材料的壳聚糖分散液滴涂在电极表面，常温下静置2 h，然后用pH7.5的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干；(3) 将上述经纳米材料修饰好的电极浸入在农药适配体溶液中，4 ℃条件下浸泡12 h，取出后用pH7.5的PBS缓冲液冲洗表面；(4) 最后将上述制备好的电极浸于0.5%的BSA溶液中，室温下静置2h，进而封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4 ℃条件下备用。

本发明的有益效果：

首先，本发明引入了一种超级电容器电极材料：导电炭黑-壳聚糖复合物，利用导电炭黑优良的导电性能及壳聚糖优异的生物相容性、成膜性，有效地提高了导电性及电容，利用氧化石墨烯-四氧化三铁复合物的壳聚糖混合溶液提高电极的比表面积，协同炭黑修饰电极，显著地增强了信号响应；

其次，本发明制备的适配体传感器检测范围较宽，线性范围为0.1-10⁵ ng/mL，检测限较低，达到0.033 ng/mL，对制备好的适配体传感器保存三周后检测，其电流响应仍可保持在初始电流的80%以上，稳定性良好，且该适配体传感器可有效地复活5次，再生性较好；

第三，本发明所制备的适配体传感器的检测结果与气相色谱法的检测结果一致，可作为蔬菜上市前农药残留快速检测的辅助手段。

附图说明

图1导电炭黑透射电镜图；(A，低倍下导电炭黑透射电镜图；B，高倍下导电炭黑透射电镜图)；

图2 氧化石墨烯、氧化石墨烯-四氧化三铁复合物扫描电镜图；(A，低倍下氧化石墨烯扫描电镜图；B，高倍下氧化石墨烯-四氧化三铁复合物扫描电镜图)；

图3 电极组装过程阻抗图谱；(a，裸玻碳电极；b，导电炭黑-壳聚糖复合物修饰后的电极；c，氧化石墨烯-四氧化三铁修饰后的电极；d，固定适配体后的电极；e，牛血清白蛋白封闭后的电极)；

图4 适配体传感器工作条件优化：pH值和孵育时间的优化；

图5 适配体传感器的工作曲线；(A，从a到h农药标准溶液的浓度分别为10⁵, 10⁴, 1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/mL；B，适配体传感器的工作标准曲线)。

具体实施方式

实施例1导电炭黑-壳聚糖纳米复合液的制备

将壳聚糖(CS)溶于1.0%的乙酸溶液中，配制0.5% CS溶液，室温下磁力搅拌至壳聚糖完全溶解，将1.0 mg导电炭黑粉末溶解于1.0 mL 上述CS溶液中，超声分散直至得到溶解均匀的复合溶液，图1为导电炭黑-壳聚糖复合物的透射电镜图，A图为低倍下扫描图，B图为高倍镜投射图；

实施例2 氧化石墨烯-四氧化三铁复合物的制备

氧化石墨烯是通过改进的Hummers方法制得，具体制备步骤如下：将石墨粉末加入H₂SO₄ (12mL）、K₂S₂O₈ (2.5 g)、P₂O₅ (2.5 g) 的混合液中，80℃反应 4.5 h，然后加入 0.5 L水稀释，并过滤洗涤以除去多余的酸，所得的预产物在室温下过夜干燥，然后将预氧化的石墨加入H₂SO₄ (120 mL)中，在冰水浴保护下逐步加入KMnO₄ (15 g)，此混合物在 35℃下搅拌反应 30 min、90℃下反应 90 min后，加入250 mL水稀释，使其沸腾反应 25 min，再搅拌 2 小时后，加入 0.7 L水和 20 mL 30%H₂O₂溶液终止反应，混合物过滤后用 1:10 的稀盐酸冲洗数次后，再用水冲洗至中性，然后将所得产物进一步透析纯化除去剩余的金属离子，透析一星期后，将得到的氧化石墨在室温条件下超声剥离 30 min，最终GO储备液的浓度大约为 0.5 mg·mL^-1，图2A即为氧化石墨烯的低倍扫描电镜图，从图中可以看到氧化石墨烯非常薄的片层结构，氧化石墨烯复合四氧化三铁是通过溶剂热法制得：40 mg氧化石墨烯混合3.0 g FeCl₃·6H₂O，9.0 g CH₃COONa 和30 mL 乙二胺 (EDA)超声得到均相溶液，将此混合溶液加热回流8 h，将混合物进行离心分离，然后分别用水和酒精清洗数次，60 ℃真空干燥即得到氧化石墨烯复合四氧化三铁，图2B即为氧化石墨烯复合四氧化三铁的扫描电镜图，球形的四氧化三铁离子负载到片层氧化石墨烯上；

实施例3 玻碳电极的清洗、活化和测试

玻碳电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液 (H₂SO₄: H₂O₂ = 3:1)中浸泡15 min，用水清洗干净，接下来用0.3 µm、30 nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水清洗去除表面污物，然后依次用6 mol/L的HNO₃、无水乙醇和去离子水各自超声清洗5 min，氮气环境下干燥。

玻碳电极的活化：彻底清洗后，电极在0.5 mol/L H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0 V~-1.0 V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。

预处理好的玻碳电极的测试：在含有1×10^-3 mol/L K₃Fe(CN)₆的0.20 mol/L KNO₃溶液中跑循环伏安曲线，扫描速度50 mV/s，扫描范围为-0.1 V~0.6 V，以测试玻碳电极的性能；当循环伏安曲线中的峰电位差在100 mV以下，所述玻碳电极可使用，否则要重新进行清洗，处理所述玻碳电极，直到符合要求，图3为玻碳电极修饰过程的阻抗图，在玻碳电极表面分别修饰炭黑-壳聚糖复合物及氧化石墨烯-四氧化三铁纳米复合物之后，阻抗值依次减小，由于二者均具有良好的导电性，固定适配体、封闭牛血清白蛋白之后，阻抗分别增大，是由于其均为蛋白分子，修饰在电极表面会形成绝缘层从而阻碍电子的传递。

实施例4 适配体传感器的制备

取7 µL分散均匀的炭黑-壳聚糖复合液滴涂在电极表面，常温下静置使其干燥，然后用pH7.5的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干，再取7 µL制备好的氧化石墨烯-四氧化三铁纳米复合物溶液滴涂在电极上，常温下干燥，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干，再将上述经纳米材料修饰的电极浸在20 µL 2.5 µM的农药适配体溶液中，4 ℃条件下浸泡12 h，取出后用PBS缓冲液冲表面，晾干待用，最后将上述电极浸入0.5%的BSA溶液中室温下静置2 h，以封闭电极上非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4 ℃条件下备用。

实施例5 适配体传感器使用条件的优化及测定

从测试底液pH和孵育时间对所制备的适配体传感器的实验条件进行优化，测试底液 pH的范围为6.0~8.5，孵育时间的范围为10~60 min，经过试验分析如图4所示，测试底液的最佳pH值为7.5，最佳孵育时间为40 min。

分别配置浓度为10⁵, 10⁴, 1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/mL的农药标准溶液，将上述制备好的适配体传感器分别浸入不同浓度的农药标准溶液，在常温下孵育40 min，检测反应前后电流变化得到其工作曲线（图5）。

选5根于相同条件下制备好的适配体传感器检测其重现性；连续15天依次检测相同浓度的农药溶液以检测其稳定性；将反应后的传感器用甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.8)解离农药5 min后再次检测其再生能力，结果表明该传感器具有良好的重现性、稳定性以及再生性。

把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次，喷洒上一定浓度的农药，放置5 h后，用10 mL丙酮/0.1 M pH7.5磷酸盐缓冲溶液(1/9, v/v)做溶剂超声处理20 min，然后再离心10 min (10000 rpm)，得到的上清液用来检测实际样品的回收率，其回收率可以达到96.0%~106.0%，加标回收率检测的相对标准偏差为1.21%~3.70%，且传感器的重现性良好。

此适配体传感器检测农药农药残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，检测农药浓度范围广，灵敏度高，再生能力高以及对实际样品分析有较好的回收率和重现性，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求，虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。