食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒及使用方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒及使用方法。

背景技术：

单核细胞增生李斯氏菌简称单增李斯特菌，是一种人畜共患病的病原菌。其能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。虽然单增李斯特菌的发病率低，但是死亡率高达20％-30％。该病菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品和蔬菜等都可被污染，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。国家对单核细胞增生李斯特氏菌污染食品造成的危害相当重视并列入了国家食品安全战略任务之一，已经将其列入国家年度食品安全风险监测检验日常项目之一。

检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法有很多，比如实时荧光聚合酶链式反应、荧光染色、免疫学方法等，虽然这些方法相比于传统培养法有一些优势，但是还存在一些无法克服的缺点，诸如操作繁琐费时、灵敏度低、不能真实反映样品的污染水平、出现“假阳性”的结果等。因此，开发快速、准确的定量检测单核细胞增生李斯特氏菌活菌的方法是非常有必要的。

免疫传感器开始应用于食源性致病菌的检测要追溯到上世纪70年代，是利用抗原抗体特异免疫反应与高灵敏传感器件相结合构成的一种生物传感器件，它具有制备简便、特异性好、操作快速、灵敏的特点，因此将免疫传感技术用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测是当前一个新的发展方向。目前，国内外有食品中致病菌的免疫分析已有一些文献报告，但大多采用酶联免疫分析(ELISA)法测定。有关免疫传感技术的研究也有一定报道，如采用免疫磁珠捕获法结合经典PCR技术检测食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、志贺氏菌等致病菌；但这些工作离实际应用仍有相当距离，因此，用微间隙生物传感器开展食品中单核细胞增生李斯特氏菌高通量的快速分析检测是一项非常有意义的工作。

技术实现要素：

针对现有技术存的空白，本发明提供一种食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒及使用方法，目的是用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速、高效检测，尤其适合大批量检测。

本发明的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，包括微间距叉指阵列电极芯片，叉指间距为20-100μm，微间距叉指阵列电极芯片的每个芯片孔中包被有100μL浓度为5μg/mL的单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体作为捕获抗体，以碱性磷酸酶标记的单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体作为识别抗体，单核细胞增生李斯特氏菌的阳性对照标准品和阴性对照标准品，底物溶液采用灭菌的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液配制的1mmol/LAAP和5mmol/L AgNO₃，并调节pH9.0。

其中，所述的微间距叉指阵列电极芯片是用超纯水清洗后每芯片孔加入200μL浓度为3％的BSA溶液，在37℃恒温孵育1h，弃去封闭液，再经超纯水洗涤三次，真空抽干过塑，4℃冷藏保存的。

所述的浓度为5μg/mL的单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体是以磷酸盐(PBS)缓冲溶液稀释，PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，采用3.62g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KH₂PO₄、0.2g NaCl和8.0g KCl加超纯水稀释至1000mL。

所述的碱性磷酸酶标记的单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体以稀释液的形式存在，采用含0.1％BSA的PBS溶液稀释。

所述的阳性对照准品是将浓度为10⁸cfu/mL的单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株的菌液100℃水浴加热15min。

所述的阴性对照标准品为PBS缓冲液。

本发明的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒的使用方法按照以下步骤进行：

(1)将到微间距叉指阵列电极工作电极的正电极与电化学工作站的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与微间距叉指阵列电极工作电极的负电极连接，采用线性扫描伏安法在0-50mV点位范围检测；

(2)取一系列已知浓度的单核细胞增生李斯特氏菌样品溶液，将其和和阳性对照、阴性对照分别加入到微间距叉指阵列电极芯片孔中，在37℃恒温反应30min；

(3)反应后用超纯水洗涤芯片三次，加入捕获抗体即碱性磷酸酶标记的单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体，在37℃恒温反应30min后再用超纯水洗涤三次；

(4)继续在芯片孔中加入100μL底物溶液，在37℃恒温避光反应15min后再用超纯水洗涤三次，电极芯片晾干，记录反应过程中记录电流随电位变化的响应曲线；

(5)以将步骤(2)中不同浓度单核细胞增生李斯特氏菌样品溶液的浓度为横坐标，响应电位为纵坐标，得到单核细胞增生李斯特氏菌浓度与响应电位的标准曲线，将未知浓度的单核细胞增生李斯特氏菌样品溶液加入到电极芯片孔中，根据所得到的响应电位和标准曲线，得到该样品中单核细胞增生李斯特氏菌浓度。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果在于：

(1)本发明的基于微间隙阵列电极的试剂盒在2h内可完成检测，操作步骤简单，可以快速准确完成检测，适合样品的大批量检测；

(2)本发明的基于微间隙阵列电极的试剂盒特异性强、灵敏度高，可实现食品中浓度10⁵cfu/mL级的单核细胞增生李斯特氏菌的检测，达到我国食品中单核细胞增生李斯特氏菌的限量标准，且背景干扰小，可以对食品中单核细胞增生李斯特氏菌进行快速筛查和检测；

(3)本发明采用碱性磷酸酶标记的单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体作为识别抗体，该标记抗体制备程序复杂，但可以节省再加入碱性磷酸酶标记的二抗这个步骤，节约检测时间约1小时；

(4)本发明可以方便的对食品样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行检测，适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性食品样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行快速检测。

附图说明

图1是本发明实施例中的96孔微间隙阵列电极示意图；

图2是本发明实施例1中基于微间隙阵列电极检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌试剂盒灵敏度实验结果图；

图3是本发明实施例1中基于微间隙阵列电极检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌试剂盒特异性实验结果图。

具体实施方式

本发明实施例中涉及的单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体购自江苏千人生物科技有限公司，作为一抗的单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体，购自江苏千人生物科技有限公司。

实施例1

本实施例对具有96孔的微间隙阵列电极试剂盒进行灵敏度测试，具体按照以下步骤进行：

(1)制备单核细胞增生李斯特氏菌菌悬液的：将菌液100℃水浴加热15min，然后进行系列稀释成10⁸cfu/mL、10⁷cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL浓度的菌液；

(2)将菌液滴加到包埋有单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体的芯片孔内，从该电极获取与单核细胞增生李斯特氏菌浓度相关的电导信号，记录变化值，如图2所示。

结果表明，单核细胞增生李斯特氏菌的浓度越高，其电导值越大，最低检测限可达10⁵cfu/mL。

实施例2

本实施例对具有96孔的微间隙阵列电极试剂盒进行特异性测试，具体按照以下步骤进行：

将单核细胞增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌O157：H7、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌(浓度为10⁷cfu/mL)作为待测样品，进行交叉反应研究，试剂盒反应结果如图3所示，只有单核细胞增生李斯特氏菌为阳性，其余均为阴性，说明该试剂盒特异性较好。

实施例3

采用本实施例的具有96孔的微间隙阵列电极试剂盒对实际样品的分析，按照以下步骤进行：

取单核细胞增生李斯特氏菌阳性样品，样品处理参考国标GB 4789.30-2010进行，即以无菌操作取检样25g，加入到含有225mL李氏增菌肉汤LB₁增菌液的均质杯中，用均质器均质1min，制成1:10的样品匀液，于30℃±1℃培养24h。移取0.1mL的液体，转种于10mL的李氏增菌肉汤LB₂增菌液内，于30℃±1℃培养18-24h，取1mL菌液到小试管中，在100℃的水浴中加热15min，取出后冷却至室温，作为待测样品。

将待测样品，同时设置阳性、阴性对照，进行测试，试剂盒反应结果只有待测样品和阳性对照为阳性，阴性对照正常，说明该试剂盒检测实际样品效果较好。