口腔微生物毒力因子的检测的制作方法

文档序号:13426392
口腔微生物毒力因子的检测的制作方法
本发明涉及用于检测和量化口腔样本中的细菌毒力因子,并且鉴定用于对口腔毒力因子解毒的试剂的方法,以及用于测定解毒试剂的效果的方法。
背景技术
:细菌细胞壁的毒素(Henkel等人,EXS.(2010)100:1-29)与健康相关问题诸如败血性休克、发烧和不适相关联(V.Liebers等人,AmJIndMed.(2006)49(6):474-91)。与健康问题相关的革兰氏阴性细胞壁毒素的示例是内毒素,诸如脂多糖(LPS)、肽聚糖和菌毛,与健康问题相关的革兰氏阳性细胞壁毒素是脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖。存在许多其它的细菌毒素,诸如内毒素和外毒素,如Henkel等人,EXS.2010;100:1-29中所报道的。就口腔环境而言,LPS和LTA似乎是细菌诱导的免疫应答的主要驱动物,或至少是最有特征性的。由身体响应于这些毒素引起的免疫应答取决于毒素的起源和个体对所述毒素的暴露历史。LPS是革兰氏阴性菌的组分,其在菌株与菌株之间不同,如由大肠杆菌(E.coli)的毒力差异所示的(Raetz和WhitfieldAnnu.Rev.Biochem(2002)71:635-700)。LPS由脂质A片段、核心区域组成,并且可具有O-抗原。已经示出脂质A片段的脂肪酸组合物响应于其与Toll样4(TLR4)受体的相互作用而确定其毒力。LTA已与各种炎性应答相关(Y.Yokoyama等人,ActaOtolaryngolSuppl.(1996)523:108-111)并且与Toll样受体2(TLR2)激活相关。普遍地据信,仅裂解的细菌释放可引发炎症应答的LPS(CA2323630)。然而,Zhang等人示出生长的细菌以与其生长阶段呈比例的含量分泌LPS(H.Zhang等人,(1998)Infection&Immunity,66(11),5196-5201)。因此,即使在刷牙之后在牙齿上留下小部分的菌斑也可由于从存在于菌斑中的革兰氏阴性菌释放LPS而引起炎症级联。检测特定细菌物种的方法已经在本领域中展示。在美国专利公布2012/019735A1中,提出了经由分光光度计法区分致病菌的方法。尽管其能够示出特定细菌的存在,但他们的发明不允许使用者确定特定位点的毒力水平。此外,他们的方法需要在实验室中培养细菌以便获得足量的LTA或LPS用于检测。因此,他们的发明缺乏检测存在不可培养物种的能力,其也不能测量生物样本的毒力。在美国专利5,175,089中,施用使用鲎变形细胞裂解物(LAL)的内毒素(LPS)测定,来测定牙周袋中的内毒素量。尽管其能够示出存在的内毒素的总量,缺乏区分患病内毒素相对于健康内毒素的能力,并且不能量化内毒素的毒力水平。此外,他们的发明将其限制于革兰氏阴性内毒素,因为LTA不可通过LAL试剂盒检测。在美国专利公布2009/0047240中,伴侣蛋白10(Cpn10)用于调节具有标记的抗体的细胞系(鼠RAW264)中Cpn10的成簇。尽管其示出了HEK细胞系中的TLR-4、7和9报告基因,但他们的体系不允许对具有较弱激活LPS的微生物群所需的更敏感或低水平的检测,因为那些基因仅处于NFkB结合位点的控制下(最小启动子)。他们的体系缺乏区分具有多种微生物物种和不存在大量生物体的生物体系所需的敏感性。此外,他们的体系需要强NFkB激活因子以克服用于其体系中的弱启动子,因此不能吸收较弱的TLRLPS激动剂,诸如来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)的LPS。此外,他们的体系缺乏检测TLR3激动剂的能力,这对表征炎性疾病如齿龈炎是不利的。美国专利公布2007/0160544描述了用于测定口腔有害细菌的方法。他们的方法要求齿龈细胞与细菌或细菌组分接触并测量炎性标志物。根据美国专利公布2007/0160544,标志物的存在指示炎症和细菌标记是有害的。相反地,认为不存在标志物指示细菌不是问题。尽管其引用了本领域已知作为产生细胞因子的路径的一部分的Toll样受体,但其方法仅允许确定细胞因子的存在。因为口腔细胞包含细菌毒力因子可对其激活的一种或多种受体,所以筛选个体受体需要使用工程化细胞,诸如包含感兴趣的受体基因的报告细胞。使天然口腔细胞诸如齿龈细胞的使用进一步复杂化的是受体如Toll样受体的表达和激活对于细胞功能是特异性的。齿龈细胞由于其与牙菌斑中微生物的不断接触而不太可能对细菌毒力因子应答。因此,需要具有工程化细胞,其中其中直接应答可经由报告体系测量。除了量化细菌组分和副产物的毒力之外,还需要有机和无机分子的炎症潜能的体外筛选,这可允许测定药代动力学参数。技术实现要素:本发明提供了一种测定口腔中细菌毒力的方法,所述方法包括提供表达至少一种toll样受体的报告细胞;提供口腔物质样本;将口腔物质样本和报告细胞混合;以及测量toll样受体激活。所述方法还可包括以下附加步骤:由在提供另一口腔物质样本之前使用口腔护理组合物的个体提供另一口腔物质样本;将另一口腔物质样本和报告细胞混合;测量toll样受体应答;以及将来自口腔物质样本和另一口腔物质样本的toll样受体应答进行比较。一种用于测定脂多糖的毒力的方法包括提供脂多糖;提供表达至少一个Toll样受体的报告细胞;将报告细胞与脂多糖混合;测量toll样受体激活;以及量化脂多糖。一种用于测定脂磷壁酸的毒力的方法包括提供脂磷壁酸;提供表达至少一个Toll样受体的报告细胞;将报告细胞与脂磷壁酸混合;测量toll样受体激活;以及量化脂磷壁酸。本发明包括利用结合、改变或化学改性细菌毒力因子和/或宿主应答机制的分子、肽和蛋白质/酶改善和/或解决齿龈炎症状态的方法。所述方法提供量化口腔组织的脂多糖含量的方式;并且利用TLR-4和TLR-2报告细胞系与检测LPS的组合,所述检测LPS经由荧光测定(诸如BODIPYTR尸胺)或内毒素检测测定(分配LPS效能和量化LPS的测定)来进行。本发明还包括能够对消费者和牙科专家传达并展示利用TLR报告细胞的测定和方案。本发明包括用于测定脂多糖的效能的方法,所述方法包括:a)提供脂多糖样本;b)提供表达一种或多种Toll样受体的报告细胞;c)将细胞暴露于脂多糖样本;d)测量脂多糖对Toll样受体激活的EC50值;e)量化脂多糖。本发明还包括从革兰氏阴性菌的生长培养物分离脂多糖。可从生物样本中分离脂多糖。生物样本包括但不限于口腔菌斑、唾液、齿龈刷样本。Toll样受体报告基因测定,诸如TLR4-SEAP和/或TLR2-SEA可用于检测并量化生物样本中的细菌毒素,包括但不限于内毒素。BODIPYTR尸胺测定可用于检测并量化生物样本中的脂多糖。此外,LAL(鲎变形细胞裂解物测定)测定或内毒素检测测定可用于检测并量化生物样本中的脂多糖。本发明可涉及用于测定口腔生物膜的效能的方法,所述方法包括:a)提供生物膜样本;b)提供表达一种或多种Toll样受体的报告细胞;c)将细胞暴露于生物膜样本;d)测量Toll样受体的生物膜激活的EC50值;e)量化脂多糖。生物膜可以为口腔菌斑,包括但不限于龈下菌斑、龈缘或龈线菌斑、龈上菌斑。本发明还可涉及用于测定口腔样本中毒力的效能的方法,所述方法包括:a)提供口腔样本;b)提供表达一种或多种Toll样受体的报告细胞;c)将细胞暴露于口腔样本;d)测量Toll样受体的生物膜激活的EC50值;e)量化脂多糖。口腔样本可包括唾液、口腔灌洗液或齿龈沟液。附图说明图1A为示出培养时细菌生长期间的LPS分泌的图。图1B为示出培养基中细菌生长的时间过程的图。图1C为示出培养时细菌生长期间的LPS分泌图。图1D为示出在培养24小时下细菌生长期间的LPS分泌图。苍白普雷沃菌(P.pallens)和变黑普雷沃菌(P.nigrescens)比牙龈卟啉单胞菌(Pgingivalis)释放更多的LPS到培养基中。图1E为示出在培养24小时下细菌生长期间每个细菌的LPS量的图。苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌比牙龈卟啉单胞菌包含更多的LPS。图1F为示出Periopaper采集的齿龈菌斑样本的图片。图2A为示出来自不同细菌的脂多糖的细胞培养物和毒力测定的图。图2B为示出培养时TLR4报告基因的激活的图。图2C为示出培养时TLR4报告基因的激活的图。图3为示出氟化亚锡抑制TLR4报告基因表达的图。图4为示出氟化亚锡抑制牙龈卟啉单胞菌激活TLR2报告基因表达的图。图5为示出通过氟化亚锡减少牙龈卟啉单胞菌LPS对TLR-4的激活的百分比的图。图6为示出激活TLR4-SEAP信号转导的龈下菌斑的EC50测定的图。来自不健康位点的牙菌斑比来自健康位点的那些具有更小的EC50,这表明来自不健康位点的牙菌斑包含更多毒力因子。图7A为示出人龈下菌斑(健康相对于齿龈炎)的TLR4评价的图。图7B为示出人口腔灌洗液(健康相对于齿龈炎)的TLR4评价的图。并且图8A为示出来自不同细菌的LTA的细胞培养和毒力测定的图。图8B为示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。图8C为示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。图8D为示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。图9为示出测定激活TLR2-SEAP信号转导的龈下菌斑的EC50图。图10A为示出人龈下菌斑(健康相对于齿龈炎)的TLR2评价的图。图10B为示出人口腔灌洗液(健康相对于齿龈炎)的TLR2评价的图。图11为示出来自不同细菌的鞭毛蛋白的细胞培养和毒力测定的图。图12A为示出人单核细胞THP-1中的LPS刺激的TLR活性的图。图12B为示出使用THP-1细胞中的IRF-Luc报告基因评价人口腔灌洗液(健康相对于齿龈炎)的图。图12C为示出使用NFkB报告基因评价THP-1细胞中的人龈下菌斑(健康相对于齿龈炎)的图。图13为示出在THP1双报告细胞中检测不同细菌的LTA的图。图14为示出临床测量的图。图15为示出在六周方案治疗期间龈上菌斑中细菌丰度减小的图。图16为示出经过六周方案治疗,颊面-刷样本中瓜氨酸浓度的图。图17为示出治疗期间,颊面刷样本中蛋白质结合鸟氨酸的图。图18为示出鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸循环中的酶的图表。图19为示出6周治疗期间鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸基因的表达的图。图20为示出在实验性齿龈炎中,颊面-刷样本中瓜氨酸浓度增加的图。图21为示出在实验诱导的齿龈炎中,颊面刷样本中蛋白质结合瓜氨酸的图。图22为示出在实验诱导的齿龈炎中,颊面刷样本中蛋白质结合鸟氨酸的浓度的图。图23为示出在实验诱导的齿龈炎中,颊面刷样本中总鸟氨酸的浓度的图。图24为示出在实验诱导的齿龈炎中,颊面刷样本中蛋白质结合精氨酸的浓度的图。图25为示出在实验诱导的齿龈炎中,颊面刷样本中总精氨酸的浓度的图。图26为示出瓜氨酸抑制THP-1细胞中由牙龈卟啉单胞菌LPS1690刺激的细胞因子产生的图。图27为示出细菌LTA以剂量依赖方式降低BC的荧光强度的图。图28为示出LPS以剂量依赖方式降低BC的荧光强度的图。图29为示出细菌培养物的上清液以剂量依赖方式降低BC的荧光强度的图。图30为示出细菌以剂量依赖方式降低BC的荧光强度的图。图31为示出EC50值的图。具体实施方式如本文所公开的,令人惊奇地发现,一种或多种方法可用于检测并量化龈下菌斑和龈上菌斑中的毒力,因此区分健康齿龈与患有齿龈炎症状的发炎位点。齿龈的健康状态可与口腔中存在的细菌毒素(例如内毒素)的含量直接相关,并且因此如本文所讨论的,这些毒素的减少(如通过筛选非齿龈工程化细胞来测定)将改善整体口腔健康。另外,个体对毒力因子的应答方式可利用个体的代谢途径来量化,诸如通过量化尿素循环的产物。齿龈炎根据FDA专著(12CFR第356章,第68卷,第103期(2003))定义为“最常由牙菌斑引发的齿龈的炎性损伤。齿龈炎的特征在于组织肿胀和发红、点彩(其中健康的齿龈表面由小叶组成的正常状态)损失、光泽表面和升高的组织温度。齿龈还在温和刺激时,诸如刷牙时出血,或可自发出血。齿龈炎通常不疼。”在该专著中,菌斑被定义为由多种细菌物种组成。这些物种对宿主组织实施恒定的炎性压力。当炎症进展到齿龈炎状态时,需要量化齿龈炎的严重程度以及口腔卫生产品的治疗在减少炎症应答方面的有效程度。由于齿龈细胞上的膜结合受体激活引起的炎症应答减少被称为解毒;并且需要测量解毒水平(这是本领域中缺少的)以教育消费者其口腔卫生的功效。齿龈炎的发病机制涉及细菌和宿主应答。本发明公开了体外测量牙菌斑中的毒力因子的方法,并且还公开了体内测量毒力因子对齿龈组织的影响的方法。这些方法允许理解牙菌斑中存在哪些毒力因子类型,以及宿主如何应答。重要的是,毒力因子的测量根据牙菌斑中微生物的毒力因子和宿主健康状况提供了对齿龈炎严重性的详细评估。此外,这些方法有助于评价技术在预防和治疗齿龈炎方面的效果。本发明包括一种方法,所述方法包括以下步骤中的一个或多个:(1)使用内毒素检测试剂盒或BODIPY-TR尸胺法量化存在于生物样本中的总LPS和LTA并且检测抑制内毒素检测测定的技术;(2)使用Toll样受体测定来确定经纯化毒力和口腔牙菌斑的效能,并测量中和毒力因子的毒性的技术的功效;(3)使用元测序来鉴定并量化龈上菌斑中的细菌,(4)测量齿龈拭子样本中的鸟氨酸和瓜氨酸以确定齿龈组织的健康状况,(5)测量蛋白质和mRNA含量以确定宿主应答水平,并且测定在抑制LPS诱导产生促炎细胞因子方面的瓜氨酸活性。上述方法和化学物质可以条形式施用到牙齿和龈线的外表面。所述条可包含着色试剂或荧光试剂以与存在的毒力因子相互作用,从而允许半定量测定存在的毒力。这将允许快速评估齿龈炎和/或牙周炎疾病的严重程度或确定口服产品的效果。本文所述方法的这种实施允许消费者在家中确定其牙齿健康的状态或允许专业人员诸如牙医快速测量患者的口腔健康状态。上述方法可用于确定有机和无机分子的细胞影响,只要分子与靶受体之间存在相互作用即可。另外,所述方法可用于确定分子是否可导致刺激或炎症应答。如本文所述,所讨论的受体将用于报告体系,并且确定所讨论的分子的分子影响。可使用与生物学应答相关的受体测定所讨论的分子的EC50值,因此减少或消除了进行动物测试的需要。除非另外指明,下文中所用的所有百分比和比率均按总组合物的重量计。除非另外指明,本文提及的所有成分的百分比、比率和含量均基于该成分的实际含量,并且不包括在市售产品中可与这些成分一起使用的溶剂、填料或其它物质。除非另外指明,本文提及的所有测量均在约25℃(即室温)下进行。如本文所用,词语“包括/包含”及其变体旨在是非限制性的,使得列表中条目的叙述不排除其它也可能在本发明的材料、组合物、装置和方法中有用的类似条目。如本文所用,词语“或”在用作两个或更多个元素的连词时,是指包括单独的所述元素或所述元素的组合;例如X或Y是指X或Y或二者。所谓“个人护理组合物”是指在常规使用过程中被施用至身体表面或与身体表面接触以提供有益效果的产品。身体表面包括皮肤,例如表皮或粘膜;身体表面还包括与身体表面相关联的结构,例如毛发、牙齿、或指/趾甲。个人护理组合物的示例包括被施用于人体以改善外观、清洁、和气味控制或整体美观的产品。个人护理组合物的非限制性示例包括毛发着色组合物、口腔护理组合物、剃须后凝胶和霜膏、剃须前制剂、剃刮凝胶、霜膏或泡沫、保湿剂和洗剂、咳嗽和感冒组合物、免洗型皮肤洗剂和霜膏、洗发剂、调理剂、沐浴凝胶、条皂、盥洗室条皂、止汗剂、除臭剂、脱毛剂、口红、粉底、睫毛膏、防晒美黑霜和防晒乳液。如本文所用,所谓“口腔护理组合物”是指在一般使用过程中不是被故意吞咽以用于特定治疗剂的全身给药的目的,而是在口腔中保留足够长的时间以接触牙齿表面或口腔组织的产品。口腔护理组合物的示例包括洁齿剂、漱口水、摩丝、泡沫、口喷剂、锭剂、咀嚼片、口香糖、牙贴白、牙线及牙线涂层、口气清新可溶解条带、或义齿护理或粘合剂产品。所述口腔护理组合物还可掺入到条或膜上,用于直接施用或粘附到口腔表面。如本文所用,术语“洁齿剂”包括牙齿或龈下糊剂、凝胶、或液体制剂,除非另外指明。洁齿剂组合物可以是单相组合物,或可以是两种或更多种单独洁齿剂组合物的组合。洁齿剂组合物可呈任何期望的形式,如深条纹的、浅条纹的、多层的、糊剂周围有凝胶的、或它们的任意组合。在包括两种或更多种单独洁齿剂组合物的洁齿剂中,每种洁齿剂组合物均可被包含于物理上独立的分配器隔室中,并且并排分配。如本文所用,术语“牙齿”是指自然牙齿以及人造牙齿或假牙。毒力因子是由致病微生物产生的分子,所述致病微生物对生物体的致病性有贡献,并使其能够侵入宿主中并在宿主中增殖,并逃避宿主免疫监视。毒力因子包括但不限于以下:革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞壁组分,诸如脂多糖和脂磷壁酸、细菌DNA、鞭毛蛋白、肽聚糖、粘附素、侵袭素和抗吞噬因子、溶血素、细菌代谢物、菌毛、外膜囊泡、细菌蛋白或细菌酶。基于Toll样受体的活性降低,毒力减少或“解毒”可用于测量各种治疗物的效果。如本文所用,术语“解毒”或“去毒”或“排毒”是指中和、减少或除去微生物毒力因子,如通过受体激活的减少所测量的,已知所述受体与工程化细胞如报告细胞系中的毒力因子应答。在某些实施方案中,基于Toll样受体中的一种或多种的激活来指定毒力的测定。本发明包括获得口腔物质样本。口腔物质可包括龈线菌斑、龈下菌斑、龈上菌斑、间质菌斑、齿龈沟液(GCF)、齿龈活检、唾液或舌拭子。口腔物质可通过本领域中已知的任何方法获得,例如,龈下菌斑样本可通过刮擦或通过使用纸尖来物理收集。菌斑可从牙槽离开牙齿下龈、形成的牙周炎袋、或在龈线处收集。例如,可将每个纸尖置于牙齿和齿龈之间的袋中10秒。在10秒之后,可移除纸尖并且置于具有700μl磷酸盐缓冲盐水的预标记的1.5ml管中。可用三个以上的纸尖重复取样程序。在收集全部四个纸尖之后,将1.5ml管密封,涡旋30秒并置于干冰上直至样本储存在-80℃冷冻机中。收集的另一种方法可包括有助于从牙齿表面释放菌斑的机械装置,诸如声波除垢器。口腔物质可在治疗从其中获得口腔物质的口腔位点之前和之后获得。从其中获得口腔物质的口腔位点包括宿主组织和细菌物质。口腔位点的进一步治疗可多于一次,并且可包括多次不同的治疗,例如方案,诸如刷牙之后漱口。除了在完全治疗之前和之后获得口腔物质之外,口腔物质还可在独立治疗之间获得,例如在刷牙之后利用漱口水之间获得。口腔物质样本与报告细胞中的Toll样受体混合。可用于本发明的Toll样受体的示例包括TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。人TLRcDNA(TLR1、2、3、4和5)首先在1998年被克隆并且其序列被公开(RockFL,HardimanG,TimansJC,KasteleinRA,BazanJF.AfamilyofhumanreceptorsstructurallyrelatedtoDrosophilaToll.ProcNatlAcadSciUSA.1998年1月20日;95:588-93)。Rock等人发现果蝇Toll和人白细胞介素1受体的细胞质结构域共享高序列同源性,并且假设两个分子都触发相关信号通路,这些信号通路与Rel-type转录因子的核移位相关。其克隆了一类假定人受体,所述假定人受体具有在细胞内区段和细胞外区段均类似于果蝇Toll的蛋白质结构。他们假设五个人Toll样受体(命名为TLR1-5)可能是蝇分子的直接同系物,并且因此可构成人先天免疫的重要且未被识别的组分。公布了TLR1至TLR5的DNA序列之后不久,也发现了其它TLRDNA序列。例如,在1999年报道了TLR6cDNA序列(TakeuchiO1,KawaiT,SanjoH,CopelandNG,GilbertDJ,JenkinsNA,TakedaK,AkiraS.Anovelmemberofanexpandingtoll-likereceptorfamily.Gene.1999年4月29日;29;231(1-2):59-65)。在2000年报道了人TLR7、TLR8和TLR9的cDNA序列(ChuangTH1,UlevitchRJ.Cloningandcharacterizationofasub-familyofhumantoll-likereceptors:hTLR7,hTLR8andhTLR9.EurCytokineNetw.2000年9月;11(3):372-8)。SEQIDNO序列1人Toll样受体1氨基酸序列2人Toll样受体2氨基酸序列3人Toll样受体3氨基酸序列4人Toll样受体4氨基酸序列5人Toll样受体5氨基酸序列6人Toll样受体6氨基酸序列7人Toll样受体7氨基酸序列8人Toll样受体8氨基酸序列9人Toll样受体9氨基酸序列本文中示出SEQIDNO:1至9的氨基酸序列的序列表以名称为“13837M_AA_Sequence_Listing_ST25”的ASCII本文文件形式与本申请同时提交。该ASCII文本文件于2016年3月29日创建并且大小为68Kb。根据MPEP§605.08和37CFR§1.52(e),该ASCII文本文件的主题以引用方式并入本文。TLR蛋白质可形成异源二聚体或同源二聚体。人类中鉴定出10种TLR基因。其基因产物形成细胞膜中的同源二聚体或异源二聚体。例如,TLR1可与TLR形成异源二聚体。类似地,TLR6还可与TLR2组装异源二聚体。另一方面,TLR4形成同源二聚体。Toll样受体(TLR)是在先天免疫体系以及消化体系中起到关键作用的一类蛋白质。它们是跨膜的非催化性受体,所述受体通常在识别源自微生物的结构保守分子的细胞如巨噬细胞、枝状体细胞和齿龈上皮细胞中表达。一旦这些微生物破坏了物理屏障诸如皮肤或肠道粘膜或口腔上皮细胞,其就被激活免疫细胞应答的TLR来识别。Toll样受体是靶向的,因为它们是由牙菌斑中微生物产生的毒力因子的主传感器。TLR1、2、4、5和6在细胞质膜中表达,从而为毒力因子被宿主受体感测提供了便利途径。TLR3、7、8和9位于核内体的膜上;并且随着毒力因子被吞噬入细胞中,其也可获得进入TLR3、7、8和9的途径。报告细胞是指真核细胞,诸如但不限于HEK293T、人单核细胞(THP1)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、鼠细胞或猴肾上皮(Vero)细胞,其被工程化以表达预定数的TLR受体,例如单个TLR受体;这与表达多个功能性TLR受体的齿龈细胞相反。因此,一种类型的工程化报告细胞仅响应于牙菌斑中的一种类型的毒力因子。与之相比,齿龈细胞表达多种类型的功能性TLR,并且不能用于鉴定牙菌斑中的单一类型的毒力因子。齿龈细胞的排出物是牙菌斑中各种毒力因子的总和。HEK293T细胞可用作报告因子,因为其容易维持并且具有与口腔上皮细胞类似的基因表达谱,使其与齿龈细胞的基因表达更密切匹配,从而使得结果将反映体内结果。与天然存在的齿龈细胞相反,本发明的报告细胞容易在实验室中保持并且表型稳定。另外,报告细胞使毒力因子的检测更简单,更加可重复,增加精确性,提供更高通量、更具特异性并且更可量化。独立的TLR受体基因稳定转染到HEK293细胞,如由Invivogen所述(/PDF/HEK_Blue_htlr4_TDS.pdf)。HEK-BlueTMhTLR4细胞被设计用于通过监测NF-kB的激活来研究人TLR4(hTLR4)的刺激。HEK-BlueTMhTLR4细胞通过hTLR4基因、MD-2/CD14辅助受体基因和分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)受体基因共转染到HEK293细胞中来获得。将SEAP报告基因置于与五个NF-kB和AP-1-结合位点融合的IL-12p40最小启动子的控制下(附件1.表达人TLR4基因的HEK-BlueTMhTLR4细胞SEAP报告293细胞,目录号hkb-htlr4,版本号15C04-MM(/PDF/HEK_Blue_htlr4_TDS.pdf)。与测量免疫应答相比,本发明的报告基因允许快速、特异性和可再现的测量毒力因子。受体激活的水平可以通过本领域已知用于所用报告基因类型的任何方法来测定。例如如果使用NFkB-SEAP报告基因,则可测量培养基中SEAP的产生。报告细胞可利用在治疗之前或之后收集的毒力因子或牙菌斑物质处理。报告基因的表达将受刺激并且当受毒力因子刺激时,SEAP被分泌到培养基中。报告基因产物SEAP的含量可用商业试剂盒容易地测量,并且将与特定类型的毒力因子量成比例。类似地,如果使用NFkB荧光素酶、NFkB-β-内酰胺、或其它报告基因,则可用的试剂盒可用于测量报告基因产物。然后可基于参数如EC50和刺激倍数来测定效能。EC50提供了关于引起炎症应答所需的毒力因子的量的量度,并且刺激的倍数指示毒力因子引起的炎性应答的严重性。EC50用于测定效能;其中如由MerckManual所定义的,“效能”是指如由分级剂量-应答曲线所描绘的,产生50%化学最大效应所需的化合物浓度(EC50)。当占用和应答之间存在线性关系时,EC50等于Kd(解离常数,其为50%的与所述受体结合的所考虑物质的量度)。通常,在受体占用和应答之间存在信号放大,这致使应答的EC50大幅小于(即位于对数剂量-应答曲线横坐标的左边)受体占用的Kd。效能取决于化合物对其受体的亲和力,以及化合物-受体交互作用与应答相关联的效率。产生效能所需的化合物的剂量与效能负相关。一般来讲,仅在造成施用不可行的大剂量化合物的需要时,低效能才是重要的。量子剂量-应答曲线提供化合物效能信息,所述信息不同于由分级剂量-应答曲线导出的信息。在量子剂量-应答关系中,EC50为50%个体表现出指定量子效应的剂量。在本发明中,内毒素或脂多糖的活性可使用内毒素检测测定或LAL测定来测量。鲎变形细胞裂解物(LAL)测试已经用于检测LPS。LAL源于鲎(Limuluspolyphemus)的血细胞、或变形细胞。目前,一些主要内毒素检测试剂源于重组蛋白质。下文中,内毒素检测测定和LAL测定互换使用。A.一种测定口腔中细菌毒力的方法,所述方法包括:a.提供表达至少一种toll样受体的报告细胞;b.提供口腔物质样本;c.将口腔物质样本和报告细胞混合;d.测量toll样受体激活。B.根据段A所述的方法,其中所述toll样受体为TLR1至TLR9中的至少一种。C.根据段A或B所述的方法,其中所述报告细胞表达TLR2或TLR4中的至少一种。D.根据段A至C中任一项所述的方法,其中所述toll样受体激活报告基因,优选地其中所述报告基因为分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。E.根据段A至D中任一项所述的方法,其中所述口腔物质样本为下列中的至少一种:龈线菌斑、龈下菌斑、龈上菌斑、间质菌斑、龈沟液(GCF)、齿龈活检、唾液或舌拭子,优选地其中所述口腔物质样本包含毒力因子,所述毒力因子为下列中的至少一种:革兰氏阳性细胞壁组分、革兰氏阴性细胞壁组分、细菌DNA、鞭毛蛋白、肽聚糖、细菌代谢物、菌毛、外膜囊泡细菌蛋白或细菌酶。F.根据段E所述的方法,其中所述口腔物质样本包含毒力因子,所述毒力因子为脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种。G.根据段A至F中任一项所述的方法,所述方法包括以下附加步骤:e.由在提供另一口腔物质样本之前使用口腔护理组合物的个体提供另一口腔物质样本;f.将另一口腔物质样本和报告细胞混合;g.测量toll样受体应答;h.将来自口腔物质样本和另一口腔物质样本的toll样受体应答进行比较。H.根据段G所述的方法,其中所述口腔物质样本和另一口腔物质样本来自同一个体。I.一种用于测定脂多糖的毒力的方法,所述方法包括:a.提供脂多糖;b.提供表达至少一种Toll样受体的报告细胞;c.将所述报告细胞与脂多糖混合;d.测量toll样受体激活;e.量化所述脂多糖。J.根据段I所述的方法,其中所述Toll样受体激活通过测量EC50或刺激倍数中的至少一个来测定。K.根据段I或J所述的方法,其中所述Toll样受体为TLR1至TLR9中的至少一种。L.根据段I至K中任一项所述的方法,其中所述报告细胞表达TLR2或TLR4中的至少一种。M.根据段I至L中任一项所述的方法,其中所述Toll样受体激活报告基因。N.根据段M所述的方法,其中所述报告基因为分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。O.根据段I至N中任一项所述的方法,其中使用鲎变形细胞溶解物测定或BODIPYTR尸胺测定中的至少一种来量化所述脂多糖。实施例实施例1—测定由细菌分泌的脂多糖细菌的生长:将大肠杆菌ATCC8739的24小时培养物的1ml等分试样用于接种250ml带导流板的烧瓶中的100mlLuria-Bertani(LB)液体培养基。然后在37℃与搅拌(220rpm)下温育该培养基并且以30分钟时间间隔取样。在SpectraMax盘式分析仪M3(MolecularDevices,Sunnydale,CA)中评估样本的浊度(OD600),这是监测微生物生长状态和生理状态的一种方法。然后记录样本浊度并且将样本在室温下以5000RPM离心10min。随后,使用如下文所述的程序,分析下文中被称为“细菌培养物的上清液”的上清液的LPS含量。用牙龈卟啉单胞菌ATCC33277、苍白普雷沃菌ATCC700821或变黑普雷沃菌ATCC25261接种20ml等分试样的MTGE液体培养基(AnaerobeSystems,MorganHill,CA)。这些培养物在WhitelyA45厌氧工作站(DonWhitleyScientific,Frederick,MD)中在37℃下以85:10:5N2:CO2:H2气体比率温育过夜。然后,这些起始培养物的1ml等分试样用于接种250ml带导流板烧瓶中的99ml膜-胰蛋白胨葡萄糖提取物(m-TGE)液体培养基。然后如先前所述,在搅拌(200rpm)下温育这些培养物,并且以规则的时间间隔取样。在TecanInfinitem200Pro(TecanTradingAG,Switzerland)中评估样本的浊度(OD600),然后在室温下以16,100×g离心10min。在分析LPS含量之前,将上清液滗析并通过0.22μM过滤器。在实验时,仅测量OD600。为了以下实验的一致性,将OD600读数转换成细菌数,尽管对于每种细菌,OD600读数和细菌数之间的关系不同。细菌数基于OD600下的分光光度计读数来评价(1.0的OD600=8×108个细胞/ml)。鲎变形细胞裂解物测定(LAL)是测定被测试样本中脂多糖(LPS)的总量的测定(PierceLAL显色内毒素量化试剂盒,ThermoFischerScientific,Waltham,MA)。按照制造商的说明进行所述测定。首先在37℃下将九十六孔微板在热块中平衡10min。将各自55μl的标准品或样本分配到微板孔中并且在37℃下将覆盖的板温育5min。然后将50μlLAL加入每个孔中。将所述板轻轻振摇并且在37℃下温育10min。加入100μl的显色底物并在37℃下温育6min。最后,加入50μl的终止剂,并且在SpectramaxM3盘式分析仪(MolecularDevice,Sunnyvale,CA)上在405-410nm下测量吸光度。图1A、1C和1D示出作为其正常生长周期的一部分,微生物脱落LPS的能力。该数据示出需要将化学物质递送到龈下菌斑以有效减轻LPS,因为刷牙通常不去除龈下菌斑。由细菌(大肠杆菌K12)脱落的LPS(如通过LAL试剂盒测量,以每ml内毒素单位计(EU/ml))如图1A所描绘的。在120分钟左右,生长培养基开始耗尽复合糖,如以图1B中的细菌生长曲线所应答的,其中LPS脱落开始下降。该数据给出了认为如果存在食物来源,则成熟的生物膜/菌斑可向宿主细胞提供恒量LPS的理由。然后LPS可具有从宿主细胞诱导炎性应答的能力。重要的是,LPS分泌到细菌培养物的上清液中(图1D)。LPS也存在于细菌壁中(图1E)。另外,该数据还强迫需要将化学物质递送到龈下菌斑以有效减轻LPS,因为刷牙通常不去除龈下菌斑。实施例2—量化牙菌斑中的毒力因子的LAL测定具有至少三个出血位点的七名专门小组成员参加该测试。具有执照的牙科保健师收集龈下菌斑样本。然后在牙齿/齿龈界面处采集样本(仅颊面),小心避免与口腔软组织接触。从每个专门小组成员取样六个龈下菌斑位点(3个健康位点和3个不健康位点)。不健康牙齿具有出血位点,其具有大于3mm的袋,并且健康位点未出血且袋深度小于2mm。在取样之前,指示专门小组成员放弃口腔卫生12小时并且避免进食、口香糖、饮水(除了小口水)。接着,在取样位点处用刮匙收集专门小组成员的龈缘菌斑。然后,从相同位点,用3个连续纸尖收集龈下菌斑样本,如图1F所示。用棉棒分离取样位点并且轻轻吹干。将纸尖(PROFLOWincorporated,Amityville,NewYork)轻轻置于袋中并持续10秒直至感到最小阻力。10秒之后,取出纸尖并且置于预标记的1.5ml管中。利用另外2个纸尖重复相同取样程序(纸尖进入单独管中)。所有专门小组成员的健康位点的第一、第二和第三样本纸尖分别汇集到三个管中,并分别标记为纸尖1、2和3。类似地,同样汇集不健康位点的样本。表1示出不健康牙菌斑比健康牙菌斑包含更多内毒素。将1MlPBS加入1.5ml管中的每个汇集样本中。将细菌在MolBioFastPrep珠磨器(MPBiomedicals,SantaAna,CA)中裂解。将样本在4℃下以10,000RPM离心10min,收集上清液并且按照制造商的说明利用LAL测定试剂盒分析,如实施例1中所述。预期在相同受试者中,在不健康位点中的龈缘菌斑比健康位点中的那些龈缘菌斑具有更多的内毒素(表1)。随后,利用名称为纸尖1、2和3的三个纸尖从龈下袋获得三个样本。同样,由纸尖1获得的龈下菌斑在不健康位点中比健康位点中具有更多内毒素(表1)。对于由纸尖2和3获得样本同样如此。重要的是,不健康龈下袋中的牙菌斑比健康袋的菌斑具有更多内毒素。这可解释不健康齿龈趋于在探测时出血的原因。实施例3—使用LAL测定试剂盒的技术开发如实施例1中所述,LAL测定被改性用于开发技术,所述技术抑制LPS在LAL测定中激活酶原。ThermoScientificPierceLAL显色内毒素定量试剂盒是用于检测LPS的定量终点测定,所述LPS在改性的鲎变形细胞裂解物测定(LAL)中催化酶原的激活。然后激活的酶原从无色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA中分裂对硝基苯胺(pNA)。产物pNA在405-410nm下光度测量。如果SnF2结合到LPS,则后者不能与LAL试剂盒中的酶原反应。因此,酶原未激活,并且无色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA将不分裂并且不产生有色产物。将牙龈卟啉单胞菌LPS1690(1ng/ml)或大肠杆菌(1ng/ml)和氟化亚锡以及如表2中所列的其它物质(50和500μM)溶于不含内毒素的水中。然后将50μlLAL加入每个孔中。将所述板轻轻振摇并且在37℃下温育10min。加入100μl的显色底物并在37℃下温育6min。最后,加入50μl的终止剂,并且在SpectramaxM3盘式分析仪(MolecularDevice,Sunnyvale,CA)上在405-410nm下测量吸光度。如表2中所示,SnF2和一些其它化合物抑制LAL测定时的LPS活性。实施例4—BODIPY-TR-尸胺与LPS结合,并且用氟化亚锡置换结合的LPS除了LPS的LAL量化之外,BODIPY方法可用于评估LPS含量。解毒技术能够靶向并中和细菌毒力因子,诸如LPS和LTA。为了开发诸如LPS和LTA螯合作用技术,使用高通量筛选来鉴定破坏由LPS和LTA和其它毒力因子对Toll样受体的激活的分子。高通量筛选利用荧光染料BODIPY-TR-尸胺5-(((4-(4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)戊胺盐酸盐(BC荧光染料),购自LifeTechnologies(Carlsbad,CA),如先前由Wood、Miller和David(2004)所述的(CombChemHighThroughputScreen,2004年5月;7(3):239-49。Anti-endotoxinagents.1.Developmentofafluorescentprobedisplacementmethodoptimizedfortherapididentificationoflipopolysaccharide-bindingagents)。在22℃下进行实验。在96孔实心黑色平底板(CorningIncorporated,Corning,NY)的孔中将大肠杆菌LPS(15μg/ml)与pH7.4的30μl50mMTris缓冲液中的SNF2和氯化鲸蜡基吡啶鎓混合10min,然后添加20μl60μMBC荧光染料,紧接着在22℃或室温下进行荧光测量。在SpectraMaxM3自动96孔板分析仪中进行荧光测量(MolecularDevice,Sunnyvale,CA)。激发波长为580nM,并且荧光发射在620nM下测量。如表3中所示,主要的抗齿龈炎技术,诸如氟化亚锡从BODIPYTR尸胺中置换LPS。表3由结合到BODIPYTR尸胺置换LPS实施例5—来自不同细菌的脂多糖的细胞培养和毒力测定报告基因细胞系,人HEK293T细胞购自Invivogen(SanDiego,CA)。HEK293T细胞用至少两种外源基因,TLR4结构基因和受NFkB转录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系在本文中命名为TLR4-SEAP。报告基因编码分泌型酶,其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启动子的控制下。此外,TLR4-SEAP细胞系还包含CD14辅助受体基因,其是将LPS转移到TLR4受体所需的。重组体TLR结合其配体,或不同的病原体结合分子,引发一系列应答,从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子,这诱导SEAP表达。细胞培养和处理:在37℃、5%CO2和95%湿度下,在T75烧瓶中,使500,000个基因报告细胞在包含补充有10%胎牛血清的DMEM培养基的15ml生长培养基中生长并保持三天。就处理而言,96孔板的孔在100μL生长培养基中以10,000个细胞/孔接种。在37℃、5%CO2和95%湿度下将所述细胞温育72小时直至第4天。在第4天,将培养基更换为测定培养基(90μl),其是不具有胎牛血清的DMEM培养基。如实施例1中所述,首先将LPS、细菌和细菌的培养基溶解或与测定培养基混合。将10μl的细菌、LPS和细菌生长的培养基加入TLR4-SEAP细胞中。24小时后取样,之后添加LPS、细菌和培养基。利用可商购获得的试剂盒量化报告基因(SEAP)的表达(CaymanChemicalCo.(AnnArbor,MI)的SEAP报告基因测定)。使用GraphPadPrism软件计算EC50(GraphPadSoftware,LaJolla,CA)。具有较低EC50的样本比具有较高EC50的那些样本在激活TLR4报告基因方面更有效。如图2A所示,来自大肠杆菌的LPS比来自牙龈卟啉单胞菌的LPS具有更低的EC50,因此比牙龈卟啉单胞菌(Pg)更有效。明尼苏达沙门氏菌(SalmonellaMinnesota)LPS不如大肠杆菌那样有效,但是比牙龈卟啉单胞菌LPS1690和1435的那些更有效。细菌的每个物种产生多种形式的LPS。来自相同物种的细菌的每种形式的LPS在刺激TLR4-下游信号通路方面具有不同效能。例如,Pg1690LPS比Pg1435/50更有效。LPS为细胞壁中的组分。同样,当其与宿主血细胞直接接触时,大肠杆菌细胞壁比牙龈卟啉单胞菌在诱导宿主细胞中产生促炎细胞因子方面更具毒力。如图2B所示,牙龈卟啉单胞菌比苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌在刺激TLR4受体基因表达方面具有高得多的EC50,这表明苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌比牙龈卟啉单胞菌更容易在宿主细胞中促进促炎细胞因子的产生。细菌将LPS释放到细菌培养物的上清液中。如图2C所示,在刺激TLR4报告基因的表达方面,苍白普雷沃菌的上清液具有类似于变黑普雷沃菌的EC50,但远低于牙龈卟啉单胞菌。同样,那些结果意味着苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌的产物比牙龈卟啉单胞菌更容易在宿主细胞中促进促炎细胞因子的产生。实施例6—开发抑制LPS对刺激经NFkB调节的报告基因表达的作用的技术氟化亚锡为P&G牙膏产品的主要的抗齿龈炎技术。进行测试以理解氟化亚锡是否可降低触发宿主细胞中的促炎性应答的能力。在存在或不存在LPS的情况下,使用如实施例5中所述的相同条件,制备TLR4-SEAP报告细胞。SEAP的生产也如实施例5所述的进行量化。图3示出62.5uM至1,000uM的各种浓度下的亚锡对100ng/ml大肠杆菌LPS的作用,如由TLR-4的激活所报告的。在500uM或更高的亚锡浓度下,TLR-4的大肠杆菌诱导水平降低。图4示出62.5uM至1,000uM的各种浓度下的亚锡对牙龈卟啉单胞菌LPS的作用,如由TLR-2的激活所报告的。在1000uM的亚锡浓度下,TLR-2的牙龈卟啉单胞菌诱导水平降低。图5中的数据示出通过来自氟化亚锡盐的亚锡离子降低LPS活性。所述数据示出1.6mM和3.2mM的氟化亚锡减少约50%的牙龈卟啉单胞菌LPS(500ng/ml)对TLP4报告体系的激活(一个星号表示P&lt;0.05,两个星号表示P&lt;0.01)。实施例7—在由临床样本激活TLR4-SEAP信号转导时的细胞培养和EC50毒力测定实施例5中所述的方法在测定不同细菌的LPS效能时是有效的。使用相同的方法测定临床样本的EC50,如实施例2中所述。如图6所示,来自不健康位点的牙菌斑比来自健康位点的那些具有更小的EC50,这表明来自不健康位点的牙菌斑包含更多毒力因子。实施例5中所述的相同方法用于检查另一研究中的临床样本。进行临床研究以评估样本收集方法和测量程序。其是受控的不知道检查者的研究。四十名专家小组成员满足纳入标准,其中为了纳入研究,每位专家小组成员必须:·提供书面知情同意来参与研究;·为18岁或更大;·同意在该研究过程中不参加任何其它口腔/牙科产品研究;·同意延迟任何选择性牙科(包括牙病预防)直至研究已经完成;·同意在治疗阶段期间避免任何形式的非特定口腔卫生,包括但不限于使用产品,诸如牙线或美白产品;·同意返回以进行所有定期访问并遵循研究程序;·必须具有至少16个天然牙齿;·处于良好的总体健康下,如基于参与研究的健康史/更新的综述,由研究者/指定人员所确定的。就不健康组而言(高出血者组):·具有至少20个出血位点(关于GBI指数,分数为1或2的位点);具有最少3个取样位点,其中出血和袋深度&gt;3mm但不深于4mm;·具有最少3个取样位点,但未出血,并且袋深度&lt;2mm就健康组而言(低出血者组):·具有最大3个出血位点(关于GBI指数,分数为1或2的位点);·不具有深于2mm的袋。二十(20)名专门小组成员定性为健康-最高达3个出血位点,并且所有袋的深度小于或等于2mm,并且二十(20)名专门小组成员定性为不健康-具有大于20个出血位点,其中至少3个袋大于或等于3mm但不深于4mm并且出血,并且至少3个袋的深度小于或等于2mm,并且取样时无出血。所有专门小组成员都具有被确定为“取样位点”的6个位点。“取样位点”具有在基线处、第2周、和第4周收集的龈上菌斑和龈下菌斑。从预确定位点中从齿龈沟获取龈下菌斑。在样本收集之前,所述位点具有利用刮匙移除的龈上菌斑。将所述位点干燥并且用另一牙科刮匙收集龈下菌斑样本(例如,Gracey13/14、15/16、11/12、7/8、1/2)。每个Gracey刮匙被设计成适用于特定区域或牙齿表面。例如,Gracey13/14被设计成适用于后牙的远端表面。来自每个位点的样本置于包含300μl的DPBS缓冲液与约50个无菌1mm玻璃珠的预标记2.0ml无菌管中。将样本储存于4℃。将龈下样本储存于-80℃直至分析。将样本在室温下解冻并且以30次振摇/秒在TissueLyserII(Qiagen,Valencia,CA,USA)中分散3min。使用PiercemicroBCA蛋白质试剂盒(ThermoFisherScientific,GrandIsland,NY,USA)测量分散的龈下样本的蛋白质浓度。通过用4ml水冲洗30秒并且然后将口腔内容物吐到离心管中,在清醒时收集口腔灌洗样本(每个专门小组成员一次)。将这些样本在家中冷冻直至其被带入冷库中的位置中。在整个研究过程中每个专门小组成员收集最多至15个样本。提交的唾液样本在-70℃下冷冻。给予所有专门小组成员以下研究的产品:在用Pro-HealthClinical护龈牙膏(0.454%氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷。专门小组成员继续其定期口腔卫生习惯,并且从基线开始到四周治疗研究结束不使用任何新产品。在四周治疗期间,专门小组成员以其习惯方式使用指定的牙粉和软手动牙刷每天早上和晚上刷牙两次。以如实施例5所述的程序,将来自上述临床研究的龈下菌斑施用于TLR4报告细胞。表7A示出从基线开始在利用CrestProHealthClinical牙膏治疗四周内的40名专门小组成员的四周研究的结果。高出血者组的出血位点中的龈下菌斑样本刺激TLR4报告基因的高表达。样本中的较多毒力引起TLR4报告基因测定中的较高RLU(相对发光单位)读数。如图7A所示,高出血者组的基线样本在出血和非出血位点上比低出血者的那些具有更高的RLU。在用Pro-HealthClinical护龈牙膏(0.454%氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后,在高出血者和低出血者组中出血和非出血位点两者处的毒力在第4周均降低。以如实施例5所述的程序,将口腔灌洗样本施用于TLR4报告细胞。如图7B所示,在TLR4-SEAP报告基因测定中评价口腔灌洗(健康相对于齿龈炎)样本。高出血者组的基线样本比低出血者的那些基线样本具有更高的RLU。在用Pro-HealthClinical护龈牙膏(0.454%氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后,高出血组中的毒力在第4周降低。实施例8—来自不同细菌的脂磷壁酸的细胞培养和毒力测定报告基因细胞系,人HEK293T细胞购自Invivogen(SanDiego,CA)。HEK293T细胞用至少两种外源基因,TLR2结构基因和受NFkB转录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系在本文中命名为TLR2-SEAP。报告基因编码分泌型酶,其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启动子的控制下。另外,在CD14已被鉴定为增强TLR应答的TLR2配体的辅助受体时,将CD14辅助受体基因转染到表达TLR2的报告基因细胞中。需要CD14辅助受体以将LTA转移到TLR2受体。重组体TLR2结合其配体或不同的病原体结合的分子,引发一系列应答,从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子,这诱导SEAP表达。细胞培养和处理:在37℃、5%CO2和95%湿度下,在T75烧瓶中,使500,000个基因报告细胞在包含补充有10%胎牛血清的DMEM培养基的15ml生长培养基中生长并保持三天。就利用LTA处理而言,96孔板的孔在100μL生长培养基中以10,000个细胞/孔接种。在37℃、5%CO2和95%湿度下将所述细胞温育72小时直至第4天。在第4天,将培养基(100μL)装入不具有胎牛血清的DMEM培养基中。如实施例7中所述,加入LTA、LPS和细菌细胞。24小时之后取样,之后添加样本。利用可商购获得的试剂盒定量报告基因(SEAP)的表达(CaymanChemicalCo.(AnnArbor,MI)的SEAP报告基因测定)。如图8A、8B、8C和8D所示,LTA、LPS、细菌和细菌培养物的上清液可结合到TLR2并且以剂量依赖性方式激活TLR2下游信号通路。如图8A所示,枯草芽孢杆菌(BS)LTA比海氏肠球菌(Enterococccushirae)的效能更大。如图8B所示,牙龈卟啉单胞菌LPS也激活TLR2报告基因的表达。例如,如图8B所示,Pg1690激活TLR2-SEAP信号转导,并刺激SEAP产生。如图8B所示,大肠杆菌LPS未激活TLR2-SEAP报告细胞。还应当注意,苍白普雷沃菌、变黑普雷沃菌和牙龈卟啉单胞菌在刺激TLR2报告基因的表达时具有相似的EC50(图8C)。然而,从三种不同的细菌释放的TLR2配体对TLR2报告基因的激活具有非常不同的EC50。实施例9—在由临床样本激活TLR4-SEAP信号转导时的细胞培养和EC50毒力测定。实施例8所述的方法在测定不同细菌的LTA和其它TLR2配体的EC50时是有效的。使用相同的方法测定临床样本的EC50,如实施例2中所述。如图9所示,来自不健康(出血)位点的牙菌斑比来自健康(未出血)位点的那些具有更小的EC50,这表明来自不健康位点的牙菌斑包含更多毒力因子。使用TLR2-SEAP报告基因测定来检查如实施例7的图7A所述的临床样本。结果示于图10A中。来自不健康组(高出血者)的不健康(出血)位点中的龈下样本比其它位点具有更多毒力因子。高出血者组的基线样本在出血位点和非出血位点上比低出血者的那些具有更高的RLU。在用Pro-HealthClinical护龈牙膏(0.454%氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后,在高出血者和低出血者组中在出血位点处,毒力在第4周均降低。使用TLR2-SEAP报告基因测定来检查如实施例7的图7B所述的临床样本。如图10B所示,评价口腔灌洗物(健康对齿龈炎)。用Pro-HealthClinical护龈牙膏(0.454%氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后,高出血组的毒力在第4周降低。实施例10—来自不同细菌的鞭毛蛋白的细胞培养和毒力测定报告基因细胞系,人HEK293T细胞购自Invivogen(SanDiegoCA)。HEK293T细胞用两种外源基因,TLR5结构基因和受NFkB转录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系被命名为TLR5-NFkB-SEAP。报告基因编码分泌型酶,其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启动子的控制下。重组体TLR5结合其配体,或不同的病原体结合的分子,并且引发一系列应答,从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子,这诱导SEAP表达。细胞培养和处理:在37℃、5%CO2和95%湿度下,在T75烧瓶中,使500,000个基因报告细胞在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中生长并保持三天。就利用鞭毛蛋白处理而言,96孔板的孔在100μL生长培养基中以10,000个细胞/孔接种。所述细胞在37℃、5%CO2和95%湿度下温育72小时直至在将细胞接种到96孔板的孔上之后的第4天。在第4天,将培养基(100μL)装入不具有胎牛血清的DMEM培养基中。以0.97ng至1μg/ml的浓度范围,添加枯草芽孢杆菌(S.subtilis)和金黄色葡萄球菌(S.Aureus)鞭毛蛋白。在添加鞭毛蛋白之后的6小时和24小时获取样本。利用可商购获得的试剂盒定量报告基因(SEAP)的表达(CaymanChemicalCo.(AnnArbor,MI)的SEAP报告基因测定)。图11示出两种鞭毛蛋白(枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)均可激活TLR5下游信号通路。来自枯草芽孢杆菌的鞭毛蛋白以剂量依赖性方式刺激TLR5-SEAP信号转导。鞭毛蛋白对TLR5的EC50在5小时为0.02ng/ml并且在23小时为0.014ng/ml。来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的鞭毛蛋白对TLR5的EC50在5小时为0.0049并且在23小时为0.0019。来自铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白对于刺激TLR5信号通路更有效。实施例11—细胞培养和来自不同细菌的LPS在THP1双报告细胞中的毒力测定细菌细胞壁和膜组分由TLR2识别。TLR2识别微生物基序PGN(肽聚糖)/脂蛋白/dectin和LPS。TLR1和TLR6与TLR2形成异源二聚体并分别结合三酰化脂蛋白和二酰化脂蛋白。THP1NFkB-SEAP和IRF-LuciaTM报告单核细胞购自Invivogen,SanDiego,CA。THP1-双细胞通过两个诱导型报告基因构建体的稳定整合源自人THP-1单核细胞系。THP1-双细胞特征在于Lucia基因在ISG54(干扰素-刺激基因)最小启动子连同五个干扰素-刺激的应答元件的控制下。THP1-双细胞还表达由IFN-b最小启动子驱动的SEAP报告基因,所述IFN-b最小启动子融合到NF-kB共有转录应答元件的五个拷贝和c-Rel结合位点的三个拷贝。因此,THP1-双细胞允许同时通过监测SEAP的活性研究NFkB途径,和通过评估Lucia的活性研究干扰素调节因子(IRF)途径(IRF-Luc)。在细胞培养上清液中可容易地测量两种报告蛋白。该THP-1细胞系具有购自Invivogen的功能性TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR8。TLR4感觉来自革兰氏阴性菌的LPS,然而TLR5识别来自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者的细菌鞭毛蛋白,TLR8检测长单链RNA。培养和处理:将THP1-双细胞在37℃和5%CO2下在T75烧瓶中在15ml生长培养基(RPMI1640与10%加热灭活的胎牛血清)中培养。每隔3至4天通过将300,000-500,000个细胞/ml接种到具有15ml的新鲜生长培养基的新鲜T75烧瓶中,使得细胞传递。为测定细菌组分对报告基因表达的影响,以90μl生长培养基中100,000个细胞接种96孔板中的孔。将10μl的细胞壁和膜组分,或加热灭活全细菌加入每个孔中。在37℃和5%CO2下培养18小时之后,用可商购获得的测定试剂盒量化分泌型荧光素酶和SEAP(对于荧光素酶,QUANTI-Luc,Invivogen,SanDiego,California;对于SEAP,SEAP报告基因测定,CaymanChemicalCo.,AnnArbor,MI)。如图12A所示,利用LPS的三种不同制剂处理DHP1-双报告细胞。所有三种LPS(ng/ml)以剂量依赖性方式激活NFkB-SEAP报告基因的产生。此外,Pg1690LPS和大肠杆菌LPS也刺激IRF-荧光素酶报告基因的表达。在结合到TLR4受体时,TLR4配体激活至少两个信号通路。一种是通用通路NFkB-SEAP,其可在所有TLR配体结合到其特异性受体时被TLR配体激活。例如,TLR2配体,LTA,可与TLR2受体结合并激活NFkB-SEAP信号通路。类似地,在结合到TLR4受体时,TLR4配体,LPS,也能够激活NFkB-SEAP信号转导。如图12A所示,大肠杆菌LPS是比牙龈卟啉单胞菌1690LPS对激活NFkB-SEAP和IRF-荧光素酶信号转导两者均更具效能的配体。THP-1细胞产生了多种功能性TLR受体。并且所有TLR受体可激活NFkB通路,因此促进NFkB-SEAP报告基因的表达。NFkB-SEAP的阅读是所有TLR受体(诸如TLR2、TLR1、TLR6和TLR4)的集体行为。来自不同细菌的所有LPS均刺激NFkB-SEAP报告基因。另一方面,IRF-荧光素酶报告基因受有限数的TLR受体,主要是TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9驱动。牙龈卟啉单胞菌LPS1690和大肠杆菌LPS以剂量依赖性方式刺激IRF-荧光素酶的表达。THP-1报告细胞用于检查临床样本,如对于实施例7的图7B所述。如图12B所示,使用THP-1细胞中的IRF-Luc报告基因评价口腔灌洗物(健康对齿龈炎)。用Pro-HealthClinical护龈牙膏(0.454%氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后,高出血组或低出血组两者中的毒力均在第4周降低。THP-1报告细胞用于检查临床样本,如对于实施例7的图7A所述。如图12C所示,使用THP-1细胞中的NFkB报告基因检查龈下菌斑(健康对齿龈炎)。高出血者组的基线样本比低出血者的那些基线样本具有更高的RLU。用Pro-HealthClinical护龈牙膏(0.454%氟化亚锡)和Indicator软手动牙刷治疗四周后,高出血组或低出血组两者的出血位点中的毒力在第4周均降低。实施例12—细胞培养和来自不同细菌和生物膜的LTA在THP1双报告细胞中的毒力测定THP1双报告细胞还表达TLR2、TLR1和TLR6受体。细菌细胞壁和一些膜组分由TLR2、TLR1和TLR6识别。TLR2识别微生物基序PGN(肽聚糖)/脂蛋白/dectin和LPS。为确定来自不同细菌的LTA是否对刺激NFkB-SEAP报告基因在THP1双报告细胞中表达具有不同作用,以与实施例11所述的相同程序制备并处理细胞。如图13所示,来自枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌两者的LTA促进报告基因在THP1双报告细胞中表达方面具有相似效能。实施例13—区分来自人原齿龈上皮细胞中不同细菌的细菌组分原人齿龈上皮细胞购自Zen-bio(ResearchTrianglePark,NC),并且在37℃下在5%CO2气氛下保持在T75烧瓶中的15ml生长培养基中(补充有CellnTec生长添加剂的CellnTec培养基中,购自CellnTecAdvancedCellSystemsAG,Bern,Switzerland)。在实验进行到24h、48h和72h时间点时,并且在测定培养基、单独的CellnTec培养基或添加剂的情况下,在37℃下在5%CO2气氛下,在100μl的CELLnTEC生长培养基中,以7,500个细胞/孔接种六个96孔板。将生长培养基更换为测定培养基,然后立即添加LPS或细菌DNA。例如,如果测定培养基为不具有添加剂的CellnTec培养基,则在每个孔中添加100μl的CellnTec培养基但不加入添加剂。如果测定培养基为生长培养基,则将100μl的生长培养基加入每个孔中。将牙龈卟啉单胞菌LPS和细菌DNA加入细胞中。在24h、48h和72h时,收集培养基用于分析。根据制造商的说明书,使用得自MesoScaleDiscovery(Rockville,MD)的Elisa试剂盒测量细胞因子。如表4中所示,用牙龈卟啉单胞菌DNA以0、0.3、1和2μg/ml处理人原齿龈上皮细胞。该培养基在处理之后的24小时和48小时收集,并且使用得自MesoScaleDiscovery的ELISA试剂盒分析六个促炎细胞因子(干扰素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α)。如表4所示,干扰素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α的表达低或几乎不可检测(每个值是一个实验中三次重复测量的平均值)。它们不是区分细菌DNA的活生物标志物。表4中的结果示出缺乏来自人齿龈上皮细胞的炎性应答,因此展示需要使用工程化细胞。表4:对于用牙龈卟啉单胞菌DNA处理的炎性标志物筛选人齿龈上皮细胞以上述程序,利用牙龈卟啉单胞菌LPS以0、0.3、1和2μg/ml用处理人原齿龈上皮细胞。如表5所示,同样干扰素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α的表达低或几乎不可检测。它们不是区分原人齿龈上皮细胞中的细菌LPS的活生物标志物。表5中的结果还示出人齿龈细胞对用于测定的细菌毒力因子不够敏感的原因,因此需要利用能够展示对毒力因子的剂量依赖性应答的细胞系。表5:对于用牙龈卟啉单胞菌LPS处理的炎性标志物筛选人齿龈上皮细胞实施例14—在六周齿龈炎治疗中,富含齿龈炎的细菌的丰度减少由69名专门小组成员进行了随机的两组临床研究(35名在阴性对照组中,并且34名在测试方案组中)。专门小组成员平均年龄为39岁,范围从20岁至69岁,并且46%的专门小组成员是女性。使治疗组良好平衡,因为对于齿龈出血指数(GBI)(平均值=29.957并且至少20个出血位点)和改性齿龈指数(MGI)(平均值=2.086)而言,人口统计特征(年龄、种族、性别)或者起始测量值没有统计学上的显著(p≥0.395)差异。所有六十九个专门小组成员均参加每次访问并完成治疗过程。经过6周时间段比较以下治疗组:测试方案:Pro-HealthClinical菌斑控制(0.454%氟化亚锡)牙粉、具有精准清洁型刷头的专业护理1000和Pro-Health清新爽洁薄荷(0.07%CPC)漱口水。对照方案:口腔保护(0.243%氟化钠)牙粉和Indicator软手动牙刷。如实施例2中所述,在临床研究时从测试方案中的相同专门小组成员收集牙菌斑。用无菌刮匙从每个小组成员的牙齿/齿龈界面处获取龈上样本,小心避免与口腔软组织接触。菌斑从所有可用天然牙齿(仅上牙弓)中取样,直至菌斑不可见。在取样之后,将菌斑样本置于预标记的(专门小组成员ID、样本缩写、访问和日期)具有1ml的PBS/甘油缓冲液和约50个无菌1mm玻璃珠的Eppendorf管中,储存在冰上直至收集所有样本。然后将样本转移到-70℃冷冻机用于储存直至进一步加工。根据制造商的说明,使用基因组DNA试剂盒(Qiagen,Germany)从龈上菌斑样本分离基因组DNA。在BGIAmericasCorporation(Cambridge,MA)进行元测序。在GlobalBiotech,Procter&GambleCompany(Mason,Ohio)分析所有数据。临床测量:与对照方案相比,在第1周、第3周和第6周,测试方案中的出血位点(GBI)显著减少(图14)。类似地,测试方案中的炎症(MGI)等级也降低(图14)。对测试方案中的龈上菌斑的基因组DNA进行测序。如图15所示,龈上菌斑中特定细菌的丰度在六周治疗中改变。在第1周和第3周,某些细菌,诸如卟啉单胞菌属口腔类279和苍白普雷沃菌减少(图15)。在治疗的四个时间段内对每种细菌物种的量作图。在六周治疗期间,某些细菌诸如口炎消化链球菌和中间普雷沃菌的量减少,如图15所示。实施例15—在6周治疗期间,随着齿龈炎症状减轻,细胞因子、趋化因子和其它生物活性蛋白质的产生减少在与实施例14所述的相同临床研究中,从与实施例14相同的专门小组成员收集齿龈-刷样本。在取样之前,专门小组成员用水漱口30秒。然后牙科卫生员用颊面拭子刷(EpicentreBiotechnologies目录号MB100SP)对龈线正上方的区域取样。将拭子立即置于1.5mlEppendorf管的1ml提取缓冲液[PBS,0.25MNaCl,1XHaltTM蛋白酶抑制剂一次性混合物(Lifetechnologies,GrandIsland,NY)]中涡旋30秒,并在干冰上立即冷冻并储存在-80C冷冻机中直至分析。从冷冻机中取出样本、解冻并通过在4℃下将样本置于试管振荡器上30分钟进行提取。所述管在Eppendorf离心机5417R(Eppendorf,Ontario,Canada)中以15000RPM离心10min,以将任何碎屑制成粒料。使用Bio-Rad蛋白质测定(BioRad,Hercules,CA)分析提取物(800μl)的蛋白质浓度。使用V-PLEX人生物标志物40-Plex试剂盒(MesoScaleDiagnosticsRockville,Maryland)测量齿龈样本中的四十种蛋白质。按照制造商的说明进行所述测定。在齿龈样本中测量的蛋白质中,促炎组1(人)、细胞因子组1(人)、趋化因子组1(人)、血管新生组1(人)、和血管损伤组2(人)中的大部分蛋白质在6周治疗期间在其丰度方面显著变化(表6)。那些包括FN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、TNF-α、GM-CSF、IL-5、IL-16、IL-7、IL-12/IL-23p40、IL-1α、VEGF-A、IL-17A、IL-15、TNF-β、IL-8(HA)、MCP-1、MCP-4、嗜酸性粒细胞趋化因子、IP-10、MDC、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、TARC、MIP-1α、MIP-1β、VEGF-C、VEGF-D、Tie-2、Flt-1/VEGFR1、PlGF、FGF(碱性)、SAA、CRP、VCAM-1、和ICAM-1。表6:齿龈-刷样本中蛋白质丰度的变化实施例16—鉴定齿龈样本中的一百七十种代谢物将与实施例15中所述的相同齿龈-刷样本用于代谢组学分析。十四名专门小组成员随机选自每个治疗组以确定在治疗的前3周期间齿龈样本中的任何代谢物浓度是否变化。将基线和第3周样本均送至Metabolon,Inc.(Durham,NC)用于代谢组学测量。鉴定并量化170种代谢物。如表7中所示,在前3周治疗期间一些代谢物浓度变化。在治疗方案组中在三周治疗后,齿龈样本中的瓜氨酸浓度降低。类似地,在三周治疗后,治疗方案组中的鸟氨酸也减少。瓜氨酸和鸟氨酸的减少可能与齿龈炎的减轻相关。表7:在基线和齿龈炎治疗期间的第3周之间齿龈刷样本中的代谢物的比较结果实施例17—在6周内方案治疗中的瓜氨酸减少齿龈-刷样本提取物中的瓜氨酸和鸟氨酸的量化使用梯度亲水性相互作用液相色谱与串联质谱(HILIC/MS/MS)进行。从与实施例14中所述临床研究相同的人专门小组成员获得齿龈-刷样本,然后将其置于如实施例15所述的提取缓冲液中。上清液经历HILIC/MS/MS和BCA分析两者。就游离的瓜氨酸和鸟氨酸分析而言,将齿龈-刷样本的提取物直接(50μl未稀释样本溶液)在50/50乙腈/超纯水与0.754%甲酸中分析或稀释五倍分析。就总瓜氨酸和鸟氨酸分析而言,将齿龈-刷样本的提取物首先使用6NHCl(50μL的提取物与450μL的6NHCl)水解,不振摇,并置于110℃下的热板上16小时。然后在室温下在真空中干燥水解样本(SavantspeedvacofLifetechnology,GrandIsland,NY),然后在1ml的稀释溶液(50/50乙腈/超纯水与0.754%甲酸)中重构用于分析。标准品和样本使用亲水梯度性相互作用液相色谱与串联质谱(HILIC/MS/MS)进行分析。使用表8所示的选择的反应监测方案,通过电喷雾电离(ESI)以正离子模式来监测分析物和对应ISTD(稳定同位素标记的内标)。通过给信号绘图构建标准曲线,本文将其定义为每个标准品与对应标准品的每个分析物质量的峰面积比率(峰面积分析物/峰面积ISTD)。然后使用生成的回归公式返算在校准基准和齿龈-刷提取样本中的每个分析物质量。作为分别从总瓜氨酸或鸟氨酸的浓度中减去游离瓜氨酸或鸟氨酸的浓度的结果,来计算蛋白质结合的瓜氨酸或鸟氨酸的浓度。所述结果记录为瓜氨酸或鸟氨酸的浓度,或者结果通过除以瓜氨酸或鸟氨酸的量乘以存在于提取物的总蛋白量来标准化。表8:分析物及其对应的稳定同位素标记的内标的多反应监测(MRM)转换分析物MRM内标MRM瓜氨酸176→159d7-瓜氨酸181→164鸟氨酸133→70d6-鸟氨酸139→76分析来自测试方案的所有专门小组成员的所有样本[Pro-HealthClinical菌斑控制(0.454%氟化亚锡)牙粉、具有精准清洁型刷头的专业护理1000和Pro-Health清新爽洁薄荷(0.07%CPC)漱口水]。如图16所述,在治疗的第一周瓜氨酸含量快速减少,并且然后在治疗的第3周和第6周持续梯度下降。这些结果与临床观察结果一致,其中齿龈出血位点(GBI)和齿龈炎症(MGI)在6周治疗阶段内减少。实施例18—经过6周治疗包含鸟氨酸的蛋白质含量减少使用如实施例17中所述的程序分析与实施例17所述相同的样本。治疗齿龈炎并持续6周。基线(BL)代表疾病状态。从第1周至第6周治疗,齿龈炎的症状减轻。如图17所示,齿龈炎中的蛋白质结合鸟氨酸(总鸟氨酸和游离鸟氨酸之间的差)较高。随着齿龈炎的严重性下降,蛋白质结合鸟氨酸逐渐减少。实施例19-在6周治疗期间齿龈样本中的鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环中的酶表达变化如实施例15所述,从与实施例15相同的专门小组成员收集齿龈样本,并在测试方案[Pro-HealthClinical菌斑控制(0.454%氟化亚锡)牙粉、具有精准清洁型刷头的专业护理1000和Pro-Health清新爽洁薄荷(0.07%CPC)漱口水]和对照方案[口腔保护(0.243%氟化钠)牙粉和Indicator软手动牙刷]情况下,将其用于检查在6周治疗期间的基因表达。收集样本后,将刷完全浸入RNAlater溶液(1.5mlEppendorf管中的1ml),以避免RNA在运输和储存期间降解(Qiagen,Valencia,CA)。将微量离心管涡旋/混合30秒,立即在干冰上冷冻,储存并从干冰上转移到实验室用于生物标志物分析。RNA分析和微阵列分析如先前在出版物中所述(OffenbacherS、BarrosSP、PaquetteDW、WinstonJL、BiesbrockAR、ThomasonRG、GibbRD、FulmerAW、TiesmanJP、JuhlinKD、WangSL、ReichlingTD、ChenKS、HoB.JPeriodontol.2009年12月;80(12):1963-82.doi:10.1902/jop.2009.080645.Gingivaltranscriptomepatternsduringinductionandresolutionofexperimentalgingivitisinhumans)。鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环由四种酶组成(图18)。循环的主要特征在于三种氨基酸(精氨酸、鸟氨酸、和瓜氨酸)可彼此转换。第一酶为鸟氨酸转氨甲酰基酶,其将氨甲酰基基团从氨甲酰基磷酸酯转移到鸟氨酸以产生瓜氨酸。该反应在线粒体的基质中发生。鸟氨酸转氨甲酰基酶的表达在治疗时减少(图19)。第二酶为精氨酸代琥珀酸合成酶。该酶使用ATP以通过形成瓜氨酰基-AMP中间体来激活瓜氨酸,其被天冬氨酸残基的氨基基团攻击以产生精氨酸代琥珀酸酯。这个反应和后续两个应答在胞质溶胶中发生。同样,精氨酸代琥珀酸合成酶的表达在治疗期间减少。第三酶为精氨酸代琥珀酸裂合酶,其催化精氨酸代琥珀酸酯裂解成富马酸和精氨酸。最后的酶为精氨酸酶。精氨酸酶裂解精氨酸以产生尿素和鸟氨酸。与鸟氨酸转氨甲酰基酶和精氨酸代琥珀酸合成酶基因的表达减少相比,精氨酸酶I和II增加(图19)。精氨酸也是一氧化氮合酶的底物,其氧化精氨酸以产生瓜氨酸和一氧化氮。一氧化氮合酶基因的表达也增加(图19)。实施例20—在实验齿龈炎中齿龈样本中的瓜氨酸增加实验齿龈炎:进行另一临床研究以确定健康人专门小组成员中的实验诱导性齿龈炎中的瓜氨酸是否增加。这是招募了60名专门小组成员的病例对照研究。研究群包括以下两组:组1或高出血者组,具有至少20个出血位点的三十(30)名专门小组成员,其中出血是基线处的GBI现场得分为1或2。组2或低出血者组,具有至少2个或更少个出血位点的三十(30)名专门小组成员,其中出血是GBI现场得分为1或2。研究由两个阶段组成:具有牙疾病预防、抛光和严格的口腔卫生的健康/严格卫生阶段;和不具有口腔卫生的诱导性齿龈炎阶段。在筛选访问时,专门小组成员进行口腔软组织评估,并具有齿龈炎评价(改性的齿龈指数(MGI)和齿龈出血指数(GBI))。在访问时,2名具有资格的专门小组成员接受口腔软组织检查之后接受齿龈炎评价,并收集齿龈菌斑和齿龈拭子以进行qPCR、蛋白质和RNA宿主生物标志物分析。在此之后,所有专门小组成员接受牙疾病预防,并进入健康/严格卫生阶段,持续两周。在严格的卫生两周之后,专门小组成员进行诱导性齿龈炎阶段,持续三周。重新评价口腔软组织检查和齿龈炎,并且在基线、第0周和第2周收集所有样本(齿龈拭子)。齿龈样本收集—使用如实施例15所述的程序从上牙弓的每一侧收集齿龈拭子。仅从颊面位点接近龈线(优选从四个相邻的牙齿-优选地从前磨牙和磨牙区域)收集齿龈拭子。专门小组成员用15ml的Listerine漱口水漱口30秒以清洁取样区域的表面。在Listerine漱口水之后,专门小组成员利用20ml水冲洗30秒。之后,用棉棒分离所选位点并且用空气注射器温和干燥,并从靠近所选牙齿的龈线的齿龈区域用收集刷/拭子获取两个齿龈拭子。将样本置于预标记的(专门小组成员ID、样本ID、访问和日期)1.5ml微离心管中,所述微离心管包含800ulDPBS(Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水)(Lifetechnologies,GrandIsland,NY)与蛋白酶抑制剂,包括AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐)2mM、抑肽酶0.3μM、苯丁抑制素130μM、EDTA(乙二胺四乙酸)1mM、E-641μM和亮抑酶肽1μM。将小瓶涡旋/混合30秒,立即在干冰上冷冻,储存并从干冰上转移到实验室用于生物标志物分析。使用实施例17中所述的程序分析来自三次访问的样本,并且示于图20中。那三次访问为基线、第0周(正好在健康/严格卫生阶段之后和在诱导性齿龈炎阶段之前)和第2周(在诱导性齿龈炎阶段结束时)。在基线和第0周时,高出血者组和低出血者组两者中的游离瓜氨酸水平均较低,但在第2周时两组中的诱导性齿龈炎均迅速上升。实施例21—实验诱导性齿龈炎中的包含瓜氨酸的蛋白质含量减少使用如实施例17中所述的相同程序。样本与实施例20中所述相同。在高出血者组和低出血者组中,齿龈组织中的蛋白质结合瓜氨酸在基线处比在第0周时更低,如图21所示。在第2周时两个组中的实验性齿龈炎较低。实施例22—在实验齿龈炎中齿龈样本的包含鸟氨酸的蛋白质含量增加使用实施例17中所述的程序分析来自实验齿龈炎(实施例20)的相同临床样本。在两组中结合的鸟氨酸在第0周均最低(图22)。其在基线处的含量高于在第0周时的那些。当在第2周时在两组中诱导齿龈炎时,结合的鸟氨酸达到峰值。另外,值得注意的是在两个组中在诱导性齿龈炎中总鸟氨酸(游离的和蛋白结合的鸟氨酸)增加(图23)。实施例23—在实验诱导性齿龈炎中齿龈样本中的包含精氨酸的蛋白质含量减小使用如实施例17所述的相同程序。样本与实施例20中所述相同。在两组中在诱导性齿龈炎中,蛋白质结合的精氨酸均最低(图24)。在两组中,其含量在第0周时比在基线处更高。齿龈刷样本中的总精氨酸显示与蛋白结合的精氨酸相同的模式(图25)。实施例24—瓜氨酸抑制LPS刺激人THP-1细胞中促炎性细胞因子的产生瓜氨酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。THP1-DualTM细胞购自Invivogen(SanDiego,California)。按照制造商的说明培养细胞,如实施例11所述。就治疗而言,首先将0.3mM至9mM的瓜氨酸加入培养基中。然后,在60分钟后加入300ng/ml牙龈卟啉单胞菌LPS1690。在治疗24小时之后,收集培养基并使用9-plex试剂盒(MesoScaleDiagnosticsRockville,Maryland)分析细胞因子产生。牙龈卟啉单胞菌LPS1690刺激细胞因子产生,如图26中所示。瓜氨酸以剂量依赖性方式抑制牙龈卟啉单胞菌LPS1690对促炎性细胞因子产生的作用。那些细胞因子包括IL-6、TNF-α、IL-12p70、IL-10、IL-2、IFN-r和IL-1β。实施例25—BODIPY-TR-尸胺与细菌及其产物的结合细菌及其产物可激活TLR2和TLR4报告基因,如实施例5和8所述。本文中,以如实施例4所述的程序,进行实验以确定不同的细菌及其产物在降低BODIPY-TR-尸胺的荧光强度(下文称为BC)方面是否具有不同的IC50。简而言之,高通量筛选利用荧光染料BODIPY-TR-尸胺5-(((4-(4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)戊胺盐酸盐(BC荧光染料),购自LifeTechnologies(Carlsbad,CA),如先前由Wood、Miller和David(2004)所述的(CombChemHighThroughputScreen,2004年5月;7(3):239-49。Anti-endotoxinagents.1.Developmentofafluorescentprobedisplacementmethodoptimizedfortherapididentificationoflipopolysaccharide-bindingagents)。所述实验在室温下进行。在96孔实心黑色平底板(CorningIncorporated,Corning,NY)的孔中将大肠杆菌LPS(15μg/ml)与pH7.4下的30μl的50mMTris缓冲液中的SnF2和氯化鲸蜡基吡啶鎓混合并持续10min,然后添加20μl的60μMBC荧光染料,紧接着在21℃或室温下进行荧光测量。在SpectraMaxM3自动96孔板分析仪中进行荧光测量(MolecularDevice,Sunnyvale,CA)。激发波长为580nM,并且荧光发射在620nM下测量。半最大抑制浓度(IC50)是细菌产物抑制BC发射荧光的有效性的量度。其通过使用GraphPadPrism软件(GraphPadSoftware,LaJolla,CA)指示抑制一半BC荧光所需的细菌物质量。如图27和28所示,每种细菌产物以剂量依赖方式降低BC的荧光强度。类似地,全细菌细胞和细菌生长的上清液也以剂量依赖性方式减少BC的荧光(图29和30)。实施例26—测定细菌毒力细菌的生长:在37℃和以200rpm振摇下,在胰蛋白酶大豆肉汤培养基(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中培养两种细菌,细菌A和细菌B。在24小时时收获细菌并且将其悬浮于0.5ml磷酸盐缓冲盐水中,标记为“存活”。将一半的“存活”细菌转移到1.5ml微管中,并加热至80℃且持续30分钟。将热处理的细菌标记为“加热灭活”或“死亡”。测量THP-1基因报告细胞中的TLR应答(NFkB-SEAP):将存活细菌和加热灭活细菌施用于THP-1细胞中,如实施例11所述。如图31所示,测定细菌A和B对THP-1细胞中NFkB-SEAP报告基因的激活的EC50。存活细菌和加热灭活(死亡)细菌两者均刺激NFkB-SEAP报告基因的表达。细菌B比细菌A在激活NFkB-SEAP报告基因的表达方面具有更低的EC50。细胞因子产生和测量:人外周血单核细胞(hPBMC)作为白细胞去除血购自AllCells公司(AllCells,Alameda,CA)。将白细胞去除血与等量的补充有9.1%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM+glutaGRO(ThermoFisher,Waltham,MA)混合。通过收集离心的Histopaque-1077(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)缓冲液密度梯度的血沉棕黄层,从血液和培养基的1:1混合物中分离hPBMC。将细胞(200,000个细胞)在补充有9.1%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的200μlDMEM+glutaGRO中培养,并用存活细菌和加热灭活细菌(6,250,000个菌落形成单位)进行处理。在添加细菌之后在24小时收获培养基,并且按照制造商的说明(MesoScaleDiagnostics,Rockville,Maryland)在试剂盒中分析促炎性细胞因子。如表9所示,两种存活细菌A和B刺激hPBMC中的细胞因子的产生。细菌B比细菌A在促进hPBMC中的IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α产生方面更有效。本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反,除非另外指明,否则每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如,公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。除非明确排除或以其他方式限制,本文中引用的每一篇文献,包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利,均据此全文以引用方式并入本文。任何文献的引用不是对其相对于任何本发明所公开的或本文受权利要求书保护的现有技术的认可,或不是对其单独地或以与任何其它参考文献或多个参考文献的组合提出、建议或公开了任何此类发明的认可。此外,如果此文献中术语的任何含义或定义与以引用方式并入本文的文献中相同术语的任何含义或定义相冲突,将以此文献中赋予该术语的含义或定义为准。虽然已经举例说明和描述了本发明的特定实施方案,但是对于本领域技术人员而言显而易见的是,在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其它变化和修改。因此,本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有这些变化和修改。序列表<110>宝洁公司(TheProcter&GambleCompany)&lt;120&gt;口腔微生物毒力因子的检测&lt;130&gt;13837M&lt;160&gt;9&lt;170&gt;PatentIn3.5版&lt;210&gt;1&lt;211&gt;786&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;智人(Homosapiens)&lt;400&gt;1MetThrSerIlePheHisPheAlaIleIlePheMetLeuIleLeuGln151015IleArgIleGlnLeuSerGluGluSerGluPheLeuValAspArgSer202530LysAsnGlyLeuIleHisValProLysAspLeuSerGlnLysThrThr354045IleLeuAsnIleSerGlnAsnTyrIleSerGluLeuTrpThrSerAsp505560IleLeuSerLeuSerLysLeuArgIleLeuIleIleSerHisAsnArg65707580IleGlnTyrLeuAspIleSerValPheLysPheAsnGlnGluLeuGlu859095TyrLeuAspLeuSerHisAsnLysLeuValLysIleSerCysHisPro100105110ThrValAsnLeuLysHisLeuAspLeuSerPheAsnAlaPheAspAla115120125LeuProIleCysLysGluPheGlyAsnMetSerGlnLeuLysPheLeu130135140GlyLeuSerThrThrHisLeuGluLysSerSerValLeuProIleAla145150155160HisLeuAsnIleSerLysValLeuLeuValLeuGlyGluThrTyrGly165170175GluLysGluAspProGluGlyLeuGlnAspPheAsnThrGluSerLeu180185190HisIleValPheProThrAsnLysGluPheHisPheIleLeuAspVal195200205SerValLysThrValAlaAsnLeuGluLeuSerAsnIleLysCysVal210215220LeuGluAspAsnLysCysSerTyrPheLeuSerIleLeuAlaLysLeu225230235240GlnThrAsnProLysLeuSerAsnLeuThrLeuAsnAsnIleGluThr245250255ThrTrpAsnSerPheIleArgIleLeuGlnLeuValTrpHisThrThr260265270ValTrpTyrPheSerIleSerAsnValLysLeuGlnGlyGlnLeuAsp275280285PheArgAspPheAspTyrSerGlyThrSerLeuLysAlaLeuSerIle290295300HisGlnValValSerAspValPheGlyPheProGlnSerTyrIleTyr305310315320GluIlePheSerAsnMetAsnIleLysAsnPheThrValSerGlyThr325330335ArgMetValHisMetLeuCysProSerLysIleSerProPheLeuHis340345350LeuAspPheSerAsnAsnLeuLeuThrAspThrValPheGluAsnCys355360365Gly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再多了解一些
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