本发明涉及医学检验
技术领域：
，尤其涉及一种糖化血红蛋白质控品的制备方法及其质控品。
背景技术：
：目前临床上测定糖化血红蛋白(HbA1c)含量的方法按照理化性质不同，可分为两大类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，如离子交换色谱法、电泳法；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构不同，如免疫法、亲和层析法及酶法等。采用不同测定方法或者同一测定方法而选用不同厂家生产的试剂，进行检测前，需要用质控品进行质量控制或校准品进行校准。目前，自制新鲜冰冻全血是HbA1c检测的良好质控物或校准品。然而，正常人的HbA1c的浓度在5％～6％之间，不同浓度值的获得具有随机性，且不可控，不利于产业化；其中HbA1c浓度值为3％～5％的临床红细胞样本很稀有，不易获得。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种糖化血红蛋白质控品的制备方法，旨在提供一种批量生产HbA1c值为3～5％的糖化血红蛋白质控品的方法。为实现上述目的，本发明提供的糖化血红蛋白质控品的制备方法，其包括以下步骤：采集非糖尿病患者的血液样本，进行离心、去浆处理，得到红细胞；向所述红细胞中加入红细胞保存液，制得红细胞样本；配制密度不同的细胞分离液，根据密度由大到小，将细胞分离液依次加入至一离心管内，得到分层液；将所述红细胞样本缓慢加入到分层液，离心得到分层的红细胞，每一密度的细胞分离液中均分散有与其适配的红细胞；将所述分层的的红细胞分装于不同的试管内，向每一试管内加入生理盐水，得到红细胞悬浮液，调节所述红细胞悬浮液的血红蛋白浓度为120g/L，筛选出HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液，获得糖化血红蛋白质控品。优选地，筛选出HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液后，所述糖化血红蛋白质控品的制备方法还包括：向HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液添加缓冲液，进行溶血处理，获得HbA1c值为3～5％的溶液和分散于所述溶液的红细胞膜；离心，去除红细胞膜；向HbA1c值为3～5％的溶液加入冻干保护剂或稳定剂中的至少一种、并进行冻干或液体冰冻保存处理，获得所述糖化血红蛋白质控品。优选地，所述缓冲液中添加有表面活性剂。优选地，所述细胞分离液的密度范围为1.085～1.127g/mL。优选地，所述血液样本的血红蛋白浓度为120～160g/L，单位体积内红细胞的个数为4×1012～5.5×1012个/L，HbA1c的浓度为4～6％。优选地，得到细胞混合物后，向所述细胞混合物中加入红细胞保存液前，还包括对所述细胞混合物进行洗涤处理的步骤，所述洗涤处理为：向所述细胞混合物中加入2～8℃的磷酸盐缓冲液，离心2～5次，并去除上清液及白膜层。优选地，所述红细胞保存液的红细胞的容积比与所述细胞混合物中的红细胞的容积比相等。优选地，所述将所述红细胞样本缓慢加入到分层液，离心得到分层的红细胞，每一密度的细胞分离液中均分散有与其适配的红细胞的步骤中，离心温度为0～20℃，离心力为1500～4000g。优选地，在将所述分层的红细胞分装于不同的试管内之后，向每一试管内加入生理盐水之前，还包括用磷酸盐缓冲液洗涤所述红细胞，并去除上清液的步骤。本发明还提出一种由所述的糖化血红蛋白质控品的制备方法所制得的质控品。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明技术方案采集非糖尿病患者的正常人的血液，最终获得的糖化血红蛋白质控品来自健康红细胞，消除了基质效应问题，提高采用该糖化血红蛋白质控品的分析仪器的测量准确性，同时也扩大了原料的来源；在红细胞中加入红细胞保存液，模拟血液的环境，从而维持红细胞的生理活性。本发明采用非连续密度梯度离心法获得不同HbA1c值的糖化血红蛋白质控品，方法简便，便于进行工业化生产。此外，制得的糖化血红蛋白质控品呈液态，能够消除瓶间差，提高采用该质控品的分析仪器的测量精度。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。本发明提供一种糖化血红蛋白质控品的制备方法，其包括以下步骤：采集非糖尿病患者的血液样本，进行离心、去浆处理，得到红细胞；向所述红细胞中加入红细胞保存液，制得红细胞样本；配制密度不同的细胞分离液，根据密度由大到小，将细胞分离液依次加入至一离心管内，得到分层液；将所述红细胞样本缓慢加入到分层液的表层，离心得到分层的红细胞，每一密度的细胞分离液中均分散有与其适配的红细胞；将所述分层的的红细胞分装于不同的试管内，向每一试管内加入生理盐水，得到红细胞悬浮液，调节所述红细胞悬浮液的血红蛋白浓度为120g/L，筛选出HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液，获得糖化血红蛋白质控品。本发明采用非连续密度梯度离心法将正常人的健康新鲜全血红细胞样本离心分离为2～6个不同密度层次，从而筛选出不同日龄的红细胞。而糖化血红蛋白(HbA1c)的百分比浓度和红细胞的寿命有关，红细胞的寿命越长，HbA1c的百分比浓度越大，反之浓度越小。据此可以得到不同HbA1c值的糖化血红蛋白质控品。优选地，红细胞保存液为含枸橼酸钠、枸橼酸、葡萄糖、腺嘌呤与磷酸二氢钠混合制成的灭菌水溶液。本发明技术方案对采集到的正常人的健康血液样本进行离心处理，将血浆和细胞分离，去除血浆后得到细胞混合物；在细胞混合物中加入红细胞保存液，模拟血液的环境，从而维持红细胞的生理活性；制备具有不同密度梯度的细胞分离液的分层液，将红细胞样本缓慢加入到分层液中，优选地，红细胞样本位于分层液的表层；离心后使得具有不同糖化血红蛋白浓度的红细胞分层，而后将其分装，加入生理盐水，调节血红蛋白浓度为120g/L，即正常人血液中血红蛋白的浓度，而后用日本爱科莱公司HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪进行检测，筛选得到HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液。本发明采用非连续密度梯度离心法获得不同HbA1c值的糖化血红蛋白质控品，方法简便，便于进行工业化生产。此外，制得的糖化血红蛋白质控品呈液态，能够消除瓶间差，提高采用该质控品的分析仪器的测量精度。筛选出HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液后，所述糖化血红蛋白质控品的制备方法还包括：向HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液添加缓冲液，进行溶血处理，获得HbA1c值为3～5％的溶液和分散于所述溶液的红细胞膜；离心，去除红细胞膜；向HbA1c值为3～5％的溶液加入冻干保护剂或稳定剂中的至少一种、并进行冻干或液体冰冻保存处理，获得所述糖化血红蛋白质控品。优选地，冻干保护剂或稳定剂为海藻糖、蔗糖、酪蛋白或动物血清白蛋白。本发明技术方案对红细胞悬浮液添加缓冲液进行溶血处理、加入冻干保护剂或稳定剂并进行冻干或液体冰冻保存，相较于红细胞悬浮液在2～8℃条件下仅能保存7天，有效延长液态糖化血红蛋白质控物或冻干复溶后的糖化血红蛋白质控物保存时间，方便用户使用。所述缓冲液中添加有表面活性剂。优选地，所述表面活性剂为TritonX-100(曲拉通X-100)、Tween-20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)。本发明技术方案的缓冲液中添加有表面活性剂，表面活性剂吸附于红细胞膜表面并插入到红细胞膜中，引起红细胞膜上的物质重排，进而导致红细胞膜破裂，有效提高溶血处理的效率。所述细胞分离液的密度范围为1.085～1.127g/mL。优选地，细胞分离液的密度可为1.085、1.0893、1.0905、1.092、1.094、1.098、1.127g/mL。分层液由至少两种不同密度的细胞分离液组成，优选地，分层液包括2、3、4、5、6层细胞分离液。本发明技术方案的细胞分离液具有与血液中红细胞相同的密度范围，使得不同密度的红细胞在相应密度的细胞分离液中处于漂浮状态，便于不同密度红细胞的分层。所述血液样本的血红蛋白浓度为120～160g/L，单位体积内红细胞的个数为4×1012～5.5×1012个/L，HbA1c的浓度为4～6％。本发明技术方案采集非糖尿病患者的正常人的血液，最终获得的糖化血红蛋白质控品来自健康红细胞，消除了基质效应问题，提高采用该糖化血红蛋白质控品的分析仪器的测量准确性，同时也扩大了原料的来源。得到细胞混合物后，向所述细胞混合物中加入红细胞保存液前，还包括对所述细胞混合物进行洗涤处理的步骤，所述洗涤处理为：向所述细胞混合物中加入2～8℃的磷酸盐缓冲液，离心2～5次，并去除上清液及白膜层。本发明技术方案在向所述细胞混合物中加入红细胞保存液前，用磷酸盐缓冲液洗涤该细胞混合物，有效去除细胞上附着的杂质。其中磷酸盐缓冲液的温度为2～8℃，保证细胞处于活性状态。所述红细胞保存液的红细胞的容积比与所述细胞混合物中的红细胞的容积比相等。本发明技术方案红细胞保存液的红细胞的容积比与所述细胞混合物相等，模拟血液环境，从而维持红细胞的生理活性。所述将所述红细胞样本缓慢加入到分层液，离心得到分层的红细胞，每一密度的细胞分离液中均分散有与其适配的红细胞的步骤中，离心的温度为0～20℃，离心力为1500～4000g。本发明技术方案对添加有红细胞的细胞分离液，置于低温离心机进行离心处理，维持红细胞的稳定状态，同时使得不同日龄的红细胞分层。离心力大于1500g，有效提高离心分离速率，小于4000g，防止离心力过大，导致红细胞破损。离心的温度为0～20℃，离心力为1500～4000g，各分层层次分明，层与层之间离散的细胞数较少，分离效果较好。在将所述分层的红细胞分装于不同的试管内之后，向每一试管内加入生理盐水之前，还包括用磷酸盐缓冲液洗涤所述红细胞，并去除上清液的步骤。本发明技术方案在将红细胞分层并分装后，用磷酸盐缓冲液洗涤，去除红细胞表面附着的杂质。本发明还提出一种由所述的糖化血红蛋白质控品的制备方法所制得的质控品。实施例一收集正常人的健康血液样本，其中：血红蛋白浓度为120g/L，单位体积红细胞的个数为4×1012个/L，HbA1c：5～6％；将血液样本先于离心机中以2000r/min离心5min，去浆，再加入4℃的PBS洗涤2次，转速也为2000r/min。用吸管小心吸弃上清液及白膜层后，得到红细胞。在红细胞中加入等红细胞容积比的红细胞保存液，充分混匀后得到红细胞样本，于4℃冰箱保存备用。设置4个Percoll细胞分离液密度梯度，依次为1.120、1.1193、1.1180、1.117g/mL，分别盛装于4个离心管内，分别取4份400μL上述红细胞样本沿离心管壁缓慢叠加于Percoll细胞分离液的最上层，设置离心机温度为4℃、离心力为3500g，离心20min，得到分为2层的红细胞。将离心管内的不同层次的红细胞用吸管精细吸取，分别装于已编号的2根试管内，每管加入4℃的磷酸盐缓冲液于离心机中，以1000r/min，离心5min，洗涤2次。而后，去上清液，向各试管内各加入生理盐水，得到红细胞悬浮液，测血红蛋白浓度，调节最终浓度为120g/L。用日本爱科莱公司HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪检测HbA1c值，选取最上层的红细胞作为样本，将Percoll细胞分离液密度的密度为1.120、1.1193、1.1180、1.117g/mL分别处理得到低HbA1c值样本编号为1、2、3、4组，其中未经处理的原始血液样本为0号。由表1可以看出，Percoll细胞分离液密度的密度为1.117g/mL时，可以分离得到HbA1c值较低的红细胞。表1不同实验组别上层红细胞HA-8180检测结果组别HbA1c值和原始值偏倚05.3％——15.3％0％25.3％0％35.2％-0.1％44.8％-0.5％在分层后的红细胞中添加含有表面活性剂的缓冲液，进行溶血处理，用离心去除杂质，加入冻干保护剂/稳定剂后，冻干或液体冰冻保存。实施例二收集正常人的健康血液样本，其中：血红蛋白浓度为120g/L，单位体积红细胞的个数为4×1012个/L，HbA1c：5～6％；将血液样本先于离心机中以2000r/min离心5min，去浆，再加入2℃的PBS洗涤5次，转速也为2000r/min。用吸管小心吸弃上清液及白膜层后，得到红细胞。在红细胞中加入等红细胞容积比的红细胞保存液，充分混匀后得到红细胞样本，于4℃冰箱保存备用。Percoll细胞分离原液为一种低渗性介质，进行配制时需加入1.5mol/L的NaCl溶液，才能使配制后的Percoll细胞分离液的渗透压达到红细胞的所需要的大小(280-320mOsm/kg·H2O)。按照如下公式：V0—未稀释的Percoll细胞分离液原液的体积，单位为mLV—稀释后的Percoll细胞分离液的体积，单位为mLρ0—未稀释的Percoll细胞分离液的密度，为1.130g/mLρ—稀释后的Percoll细胞分离液的密度ρ10—1.5mol/L的NaCl溶液的密度，为1.058g/mL计算配制不同密度分离液时3种液体(Percoll细胞分离液原液、0.9％生理盐水、1.5mol/L的NaCl溶液)的配比。用Percoll细胞分离液原液和0.9％的生理盐水、1.5mol/L的NaCl溶液配制6种不同密度的分离液，密度由低至高分别为1.085、1.0893、1.0905、1.092、1.094、1.098g/mL(依次记为1、2、3、4、5、6，未处理的全血记为0)。将上述分离液按照密度由大到小，依次加入到一离心管中，最后将红细胞样本加入到离心管中，此时红细胞样本位于分层液的表层。离心条件设置为3500g、10℃，离心20min，红细胞位于相应密度的细胞分离液中。将离心后离心管内的不同层次的红细胞用吸管精细吸取，分别装于已编号的6根试管内，去上清液，向各管内各加入1mL的生理盐水，制得红细胞悬浮液，调节红细胞悬浮液的血红蛋白浓度为120g/L。用日本爱科莱公司HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪进行检测，测得该六层红细胞的HbA1c值，如表2所示，从上到下依次为：3.5％、3.8％、4.2％、4.5％、4.8％、5.3％。说明用此方法可以获得6个HbA1c水平的产品，其中HbA1c值为3.5％、3.8％、4.2％、4.5％、4.8％的红细胞悬浮液，是较理想的低糖化血红蛋白质控品。表2不同层红细胞HA-8180检测结果层别HbA1c值和原始值偏倚05.2％——13.5％-1.7％23.8％-1.4％34.2％-1.0％44.5％-0.7％54.8％-0.4％65.3％0.1％将上述HbA1c值为3.5％、3.8％、4.2％、4.5％、4.8％的红细胞悬浮液放置于冰箱中备用，在2～8℃条件下可保存7天。采用添加有TritonX-100的0.05％的NaCl溶液，对红细胞悬浮液进行溶血处理，离心去除杂质，向离心得到的溶液中加入动物血清白蛋白，进行液体冰冻处理，得到的糖化血红蛋白质控品可保存3个月。实施例三收集正常人的健康血液样本，其中：血红蛋白浓度为160g/L，单位体积红细胞的个数为5.5×1012个/L，HbA1c：6％；将血液样本先于离心机中以2000r/min离心5min，去浆，再加入8℃的PBS洗涤5次，转速也为2000r/min。用吸管小心吸弃上清液及白膜层后，得到红细胞。在红细胞中加入等红细胞容积比的红细胞保存液，充分混匀后得到红细胞样本，于4℃冰箱保存备用。用Percoll细胞分离液原液和0.9％的生理盐水、1.5mol/L的NaCl溶液配制6种不同密度的分离液，密度由低至高分别为1.085、1.0893、1.0905、1.092、1.094、1.098g/mL(依次记为1、2、3、4、5、6，未处理的全血记为0)。将上述分离液按照密度由大到小，依次加入到一离心管中，最后将红细胞样本加入到离心管中，此时红细胞样本位于分层液的表层。离心条件设置为4000g、20℃，离心20min，红细胞位于相应密度的细胞分离液中。将离心后离心管内的不同层次的红细胞用吸管精细吸取，分别装于已编号的6根试管内，去上清液，向各管内各加入1mL的生理盐水，制得红细胞悬浮液，调节红细胞悬浮液的血红蛋白浓度为120g/L。用日本爱科莱公司HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪进行检测HbA1c值，筛选出HbA1c值为3～5％的红细胞悬浮液，在2～8℃条件下保存备用。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页1 2 3