一种检测血清淀粉样蛋白A的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法和用途与流程

本发明描述了一种检测牛血清淀粉样蛋白A的酶联免疫吸附分析试剂盒及其制备方法和用途，用于检测牛奶中血清淀粉样蛋白A的浓度，并以此诊断牛隐性乳房炎。属分析测试领域。

背景技术：

乳房炎(Mastitis)是奶牛最常见、最多发、导致经济损失最严重的疾病之一，并危害着人类健康，这是因为乳房炎奶牛的乳汁中往往含有大量病原微生物、毒素或治疗后残留的抗生素，食用后可引起发热、呕吐、腹泻及过敏等不良反应。随着我国奶牛业和乳品工业的发展及人类对公共卫生的重视，奶牛乳房炎的危害已引起人们的广泛关注和高度重视。

乳房炎不仅使奶牛产奶量显著下降而造成严重经济损失，还可导致乳汁成分发生改变，使牛奶的营养价值和食用价值显著下降。

奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎。临床型乳房炎会导致牛奶分泌大幅度下降，严重时奶牛甚至完全不能泌乳。隐性乳房炎发病率高，作用时间更长，而且长期潜伏在牛群中不易诊断。奶牛日产奶量与隐性乳房炎发病程度呈显著负相关，因此隐性乳房炎实际上比病例数较少的临床型乳房炎造成的经济损失更大。

美国国家乳房炎委员会(National Mastitis Council,NMC)1996 年的调查数据显示每年全世界约三分之一的奶牛感染乳房炎，其直接经济损失达 20 亿美元，而仅加拿大一个国家，奶牛乳房炎造成的直接经济损失就达到了 7 亿英镑。同时，乳房炎被列为淘汰奶牛的主要原因，美国淘汰奶牛的 26.5%是因为患乳房炎，在芬兰、挪威、瑞典因奶牛乳3房健康问题分别淘汰了奶牛的 35%、19%和 22%。我国目前奶牛存栏数为 600 万～700万头，主要集中在黑龙江、内蒙古及河北等地区，调查表明，奶牛乳房炎在我国的发病率达 70%～80%，每年造成的直接经济损失约为 30 亿元人民币。

目前检测奶牛隐性乳房炎主要是依靠检测牛奶中的体细胞数来进行，即牛奶SCC。牛奶体细胞数是目前衡量奶牛乳房炎的常用标准。其原理是当奶牛的泌乳系统受到各种细菌的侵袭而发生感染和损伤时，由于机体的免疫机制，血液中承担排除感染和修复任务的白细胞就会穿越毛细血管壁和乳腺泡壁层，进入腺泡腔而进入乳汁中，引起乳汁中体细胞总数的升高。因此，可通过乳汁 SCC 的变化来判断是否是隐性乳房炎。

但是牛奶体细胞数的变化受到很多因素的影响，如年龄、泌乳期、昼夜、挤奶过程、病原菌感染等。导致目前的体细胞检测不能完全诊断奶牛乳房炎。

近年来的研究发现，感染、创伤、炎症等应激原作用于动物机体，造成机体稳态失衡，会引起一系列反应，如发热、负氮平衡、白细胞增多、促肾上腺皮质激素和糖皮质激素分泌增多、补体系统和凝集系统激活、血清微量元素浓度改变及一些血浆蛋白浓度的改变等。在应激刺激下所产生变化的蛋白即为急性期蛋白(Acute Phase Protein,APP)，又叫急性期反应物或应激敏感蛋白质。

在奶牛发生隐性乳房炎时，急性期蛋白APP浓度会发生急剧变化。因此急性期蛋白APP作为奶牛乳房炎的生物标记物，成为继乳汁体细胞数之后，另一种奶牛乳房炎的诊断标准。

奶牛发生乳房炎后，在各种致炎因子作用下，肝脏迅速合成 APP，其浓度在血清和乳汁中都会上升，其中最显著的是血清淀粉样蛋白A（SAA）。通过分析牛奶中血清淀粉样蛋白A含量直接反应奶牛乳房的炎症状态。

血清淀粉样蛋白A（SAA）是一种小型的疏水蛋白，分子量约为 9～14kDa。人类 SAA 有 4 种亚型，在急性炎症或组织损伤的刺激下，血清 SAA1和 SAA2浓度可在 5～6h 内迅速升高约 1000 倍，而 SAA4几乎没有变化，因此，把 SAA1和 SAA2合称为 SAA 或急性期 SAA(A-SAA)，而把 SAA4称为组成性 SAA(C-SAA)。SAA 是淀粉状蛋白的前体，所以 SAA 和淀粉样变性病的发病机理有关。奶牛发生急性炎症时 SAA 升高幅度比发生慢性炎症时大；奶牛试验性曼氏溶血性不动杆菌、呼吸道合胞病毒病和乳房炎，都可以引起 SAA 浓度的升高。

市场上目前有销售的国外检测牛血清淀粉样蛋白A的试剂盒。主要目的是筛查自身免疫性疾病。因为血清淀粉样蛋白A是一种验证相关的急性期蛋白APP，在很多疾病的过程中都有表达。血清淀粉样蛋白A是一个蛋白家族，人的SAA有4种亚型，而牛的SAA常见有5-8种亚型。主要在血清中表达。SAA在很多疾病过程中都有提高。市场上的SAA检测试剂盒，采用8种SAA混合抗原抗体，主要是用于检测血清中的SAA含量，为自身免疫疾病提供参考。

在牛的SAA家族中，只有几种是与奶牛隐性乳房炎相关的。其中只要1种是牛的乳腺表达，而不是在血清中表达的。在我们的前期研究中，筛选出了在牛乳腺表达的SAA蛋白，叫乳腺血清淀粉样蛋白A（M-SAA或者MAA）。S-MAA在奶牛乳房炎的时候，含量会急剧升高。

Gabriele Gerardi [Proprietors of Journal of Dairy Research 2009，411]等详细研究了M-SAA与奶牛隐性乳房炎的关系，并且牛奶中SAA的浓度变化来诊断奶牛的隐性乳房炎。S. Jacobsen等[Veterinary Immunology and Immunopathology 104 (2005) 21–31]等研究了M-SAA蛋白的生物学特征，并且以M-SAA浓度变化作为诊断奶牛隐性乳房炎的指标。近年来越来越多的研究表明，急性期蛋白APP是诊断奶牛隐性乳房炎的有效指标，其中奶牛血清淀粉样蛋白A（SAA）是最有效的参考指标。

目前对于牛奶中血清淀粉样蛋白A（SAA）的检测还没有有效的方法。本发明描述了一种酶联免疫吸附试剂盒，用于测定牛奶中血清淀粉样蛋白A的浓度，进而为奶牛隐性乳房炎诊断提供依据。

在本发明中，我们根据牛乳腺血清淀粉样蛋白A的特异性基因序列，克隆并表达了重组的牛乳腺血清淀粉样蛋白A（M-SAA）；并制备了牛乳腺血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体；以此为基础，研制了牛血清淀粉样蛋白A酶联免疫吸附试剂盒。用于诊断奶牛的隐形乳房炎。

技术实现要素：

本发明提供了一种酶联免疫吸附分析试剂盒及其制备方法，用于测定牛奶中牛血清淀粉样蛋白A的浓度，进而为奶牛隐性乳房炎诊断提供依据

为解决上述技术问题，本发明提供了一种酶联免疫吸附分析试剂盒，该试剂盒包括：

1)用牛血清淀粉样蛋白A（SAA）抗体包被的酶标板

2)牛血清淀粉样蛋白A(SAA)标准品

3)标准品稀释液

4)牛血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体

5)酶标记的羊抗鼠IgG抗体

6)洗涤液

7)底物

8)显色剂

9)终止液。

该试剂盒通过下述方法获得

1.牛血清淀粉样蛋白A基因（SAA GeneBank ID NM_00181016.3）通过PCR扩增后，克隆到表达载体PET28中，将其转化大肠杆菌BL21后，通过IPTG诱导表达，得到重组的牛血清淀粉样蛋白A

2.将重组的牛血清淀粉样蛋白A(SAA)纯化，免疫小鼠，通过细胞融合和筛选后，制备得到SAA的单克隆抗体

3.利用纯化的牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和重组牛血清淀粉样蛋白A抗原通过下述方法制备酶联免疫试剂盒

1)包被有牛血清淀粉样蛋白A抗体的酶标板制备

w 包被

将牛血清淀粉样蛋白A抗体用PH6-8的0.01-0.05M PBS缓冲液稀释，终浓度为1-50ug/ml，按照每孔100-300ul的量加入到酶标板的微孔中。在37℃孵育1-4小时或者4℃孵育过夜；

w 洗涤

用0.01-0.05M的PBS缓冲液，加入0.1%的Tween20洗涤酶标板3-5次；

w 封闭

在上述酶标板中每孔加入300ul封闭液（10%小牛血清或者3%脱脂奶粉）室温封闭1-3小时；

w 洗涤

用0.01-0.05M，PH6-8的PBS缓冲液加入0.1%Tween20缓冲液洗涤酶标板3-5次；

w 干燥

在20-37℃干燥5-10小时，使酶标板干燥；

干燥后就得到包被有牛血清淀粉样蛋白A抗体的酶标板

2)标准品稀释液配制

配制0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS，调节PH至PH7.4

3)牛血清淀粉样蛋白A标准品配制

将重组表达纯化的牛血清淀粉样蛋白A用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，配制终浓度为10ug/ml的牛血清淀粉样蛋白A标准品

4)牛血清淀粉样蛋白A抗体配制

牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，配制终浓度为10ng/ml的牛血清淀粉样蛋白A标准品

5)酶标记的羊抗鼠IgG抗体配制

将HRP标记的羊抗鼠IgG用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4做1:10000稀释

6)洗涤液配制

在0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4中加入0.1%的Tween20

7)底物液配制

过氧化氢脲用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，终浓度为1mg/ml

8)显色液配制

四氨基联苯胺TMB用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，终浓度为0.1mg/ml

使用前底物液和显色液1:1混合，配制显色底物

9)终止液配制

2mol/L H2SO4。

该试剂盒使用方法如下:

1.牛血清淀粉样蛋白A标准品配制

w取6支离心管，编号A、B、C、D、E和F；

w管F中取900µL标准品稀释液，加入100µL 试剂盒中的牛血清淀粉样蛋白A标准品（10ug/mL）混匀，配制1ug/ml标准品；

w管E中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品F，混匀，作1:2稀释，配制成标准品E；

w管D中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品E，混匀，作1:2稀释，配制成标准品D；

w管C中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品D，混匀，作1:2稀释，配制成标准品C；

w管B中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品C，混匀，作1:2稀释，配制成标准品B；

w管A中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品B，混匀，作1:2稀释，配制成标准品A；

w以标准品稀释液作为标准品0，即空白标准品。共配制成6个浓度标准品系列

2.从铝箔袋中取出所需数量的牛血清淀粉样蛋白A抗体包被的酶标板板条，装至微孔板架上。标准品0、A、B、C、D、E和F各2孔，其余各孔为待测样品，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀

3.用封板膜将微孔板密封，置37℃温育60分钟

4.弃去微孔板反应孔内液体，每孔加入350μL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共5次，最后拍干

5.每孔加 牛血清淀粉样蛋白A抗体100μL，用封板膜将微孔板密封，置37℃温育30分钟

6.弃去微孔板反应孔内液体，每孔加入350μL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共5次，最后拍干

7.每孔加入酶标记的羊抗鼠IgG抗体100ul，置37℃温育30分钟

8.弃去微孔板反应孔内液体，每孔加入350μL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共5次，最后拍干

9.每孔加底物缓冲液和显色剂各50μL，用封板膜将微孔板密封，置室温（18~30℃）避光温育30分钟

10.每孔加终止液50μL，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀

11.终止反应后1小时内，用酶标仪在450nm波长处，测定各孔吸光度值，参考波长选择620-700nm。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供了一种牛血清淀粉样蛋白A的酶联免疫吸附分析检测方法，能够快速，定量的测定牛奶中的血清淀粉样蛋白A的浓度

2.本发明利用了抗原抗体特异性结合的原理，检测特异性好，不受牛奶中基质的影响

3.利用牛血清淀粉样蛋白A含量变化检测奶牛隐性乳房炎，不受奶牛胎次、年龄、泌乳周期、挤奶过程等影响，结果相对稳定。

附图

M：蛋白质分子量标记

1：牛血清淀粉样蛋白A重组表达菌液

2：小鼠腹水

3：牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体

图1：重组牛血清淀粉样蛋白A表达图谱

图2：牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体纯化图谱

图3：牛血清淀粉样蛋白A酶联免疫吸附分析试剂盒标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：重组牛血清淀粉样蛋白A的重组表达和纯化

1.牛血清淀粉样蛋白A(HP)基因克隆

利用软件对牛血清淀粉样蛋白A(SAA)基因进行序列分析（GeneBank ID NM_001040470.2），设计PCR扩增引物，扩增出SAA基因，并在两端加入酶切位点NdeI和BamHI.

2.HP基因克隆至表达载体

将扩增的SAA基因双酶切后，插入表达载体pET28a中，构建重组质粒pET28a/SAA。酶切和序列测定鉴定重组质粒

3.HP基因诱导表达

将重组质粒pET28a/HP转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性克隆。挑取阳性单克隆接种LB kan+培养基，37℃ 200rpm培养过夜。 第二天 按照1%的接种量接种到ZYM-5052培养基中进行自诱导表达。取诱导后的菌液与不含重组质粒的菌液做对比，检测表达情况

ZYM-5052培养基含有 1% N-Z-amine AS, 0.5% 酵母提取物,25 mM Na2HPO4, 25mMKH2po4, 50mM NH4Cl, 5mM NaSO4, 2mM MgSO4, 0.2×微量元素，0.05%葡萄糖，0.5%甘油以及0.2% α-乳糖

4.重组SAA蛋白的纯化

重组表达的SAA蛋白采用Ni-琼脂糖凝胶亲和层析纯化，用20mM PBS上样，采用含有20mM和50mM咪唑的PBS洗脱结合的SAA蛋白

重组表达的SAA蛋白电泳图谱见图1。

实施例2：重组牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备的制备

1.牛血清淀粉样蛋白A杂交瘤细胞株建立：

用纯化的重组HP蛋白免疫BALB/C小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂颈背部和腋下皮下多点注射，加强免疫用弗氏不完全佐剂颈背部皮下、腋下及足垫注射。每隔两周采血检测抗体滴度。8周后取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0做细胞融合。用重组的HP和灭活的LM进行间接ELISA筛选。选择强阳性细胞继续培养，并采用有限稀释法获得能分泌抗体的单克隆。筛选得到的单克隆细胞扩增后液氮冻存保种

2.SAA腹水制备和单克隆抗体纯化

杂交瘤细胞腹腔注射经液体石蜡处理过的BALB/C小鼠，每只约2×10⁶个细胞，2周后收集腹水。腹水5000rpm离心10min去除细胞碎片及脂类。上清过Protein G Hitrap亲和柱。收集的抗体用BCA法检测蛋白浓度，用SDS-PAGE电泳检测抗体纯度

电泳结果显示，牛血清淀粉样蛋白AHP单克隆抗体纯度超过95%

牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体电泳图谱见图2。

实施例3：牛血清淀粉样蛋白A酶联免疫吸附试剂盒的制备

1.包被有牛血清淀粉样蛋白A抗体的酶标板制备

w 包被

将牛血清淀粉样蛋白A抗体用PH6-8的0.01-0.05M PBS缓冲液稀释，终浓度为1-50ug/ml，按照每孔100-300ul的量加入到酶标板的微孔中。在37℃孵育1-4小时或者4℃孵育过夜

w 洗涤

用0.01-0.05M的PBS缓冲液，加入0.1%的Tween20洗涤酶标板3-5次

w 封闭

在上述酶标板中每孔加入300ul封闭液（10%小牛血清或者3%脱脂奶粉）室温封闭1-3小时

w 洗涤

用0.01-0.05M，PH6-8的PBS缓冲液加入0.1%Tween20缓冲液洗涤酶标板3-5次

w 干燥

在20-37℃干燥5-10小时，使酶标板干燥

干燥后就得到包被有牛血清淀粉样蛋白A抗体的酶标板

2.标准品稀释液配制

配制0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS，调节PH至PH7.4

3.牛血清淀粉样蛋白A标准品配制

将重组表达纯化的牛血清淀粉样蛋白A用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，配制终浓度为10ug/ml的牛血清淀粉样蛋白A标准品

4.牛血清淀粉样蛋白A抗体配制

牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，配制终浓度为10ng/ml的牛血清淀粉样蛋白A标准品

5.酶标记的羊抗鼠IgG抗体配制

将HRP标记的羊抗鼠IgG用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4做1:10000稀释

6.洗涤液配制

在0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4中加入0.1%的Tween20

7.底物液配制

过氧化氢脲用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，终浓度为1mg/ml

8.显色液配制

四氨基联苯胺TMB用0.01mol/L的磷酸缓冲液PBS PH7.4溶解，终浓度为0.1mg/ml

使用前底物液和显色液1:1混合，配制显色底物

9.终止液配制

2mol/L H2SO4。

实施例四：利用牛血清淀粉样蛋白A酶联免疫吸附分析试剂盒检测牛奶中的牛血清淀粉样蛋白A含量

1.牛奶样本处理

取原奶10ml，3000×g 离心20min。去除上层的乳脂。下层牛奶待检

2.牛血清淀粉样蛋白A标准品配制

w 取7支离心管，编号A、B、C、D、E、F和0；

w 管F中取900µL标准品稀释液，加入100µL 试剂盒中的牛血清淀粉样蛋白A标准品（10ug/mL）混匀，配制1ug/ml标准品；

w 管E中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品F，混匀，作1:2稀释，配制成标准品E；

w 管D中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品E，混匀，作1:2稀释，配制成标准品D；

w 管C中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品D，混匀，作1:2稀释，配制成标准品C；

w 管B中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品C，混匀，作1:2稀释，配制成标准品B；

w 管A中取500µL标准品稀释液，加入500µL标准品B，混匀，作1:2稀释，配制成标准品A；

w 以标准品稀释液作为标准品0，即空白标准品。共配制成6个浓度标准品系列

3.从铝箔袋中取出所需数量的牛血清淀粉样蛋白AHP抗体包被的酶标板板条，装至微孔板架上。标准品0、A、B、C、D、E和F各2孔，其余各孔为待测样品，将上述处理后的牛奶样本加入待检孔。标准品与待检奶样均加入100ul，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀

4.用封板膜将微孔板密封，置37℃温育60分钟

5.弃去微孔板反应孔内液体，每孔加入350μL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共5次，最后拍干

6.每孔加 牛血清淀粉样蛋白A抗体100μL，用封板膜将微孔板密封，置37℃温育30分钟

7.弃去微孔板反应孔内液体，每孔加入350μL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共5次，最后拍干

8.每孔加入酶标记的羊抗鼠IgG抗体100ul，置37℃温育30分钟

9.弃去微孔板反应孔内液体，每孔加入350μL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共5次，最后拍干

10.每孔加底物缓冲液和显色剂各50μL，用封板膜将微孔板密封，置室温（18~30℃）避光温育30分钟

11.每孔加终止液50μL，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀

12.终止反应后1小时内，用酶标仪在450nm波长处，测定各孔吸光度值，参考波长选择620-700nm

检测结果显示，两个牛奶样本中牛血清淀粉样蛋白AHP的含量分别为A：1200ng/ml和B：300ng/ml

试剂盒检测的标准曲线见图3。

牛血清淀粉样蛋白A基因序列，GeneBank ID NM181603.1

1 caccaggagc ctcagcagga gggcacggcc acaggatgaa cctttccacg ggcatcattt

61 tctgcttcct gatcctgggc gtcagcagcc agagatgggg gacattcctc aaggaagctg

121 gtcaaggggc taaagacatg tggagagctt accaagacat gaaagaagcc aactacaggg

181 gtgcagacaa atacttccac gcccgtggaa actatgacgc tgcccgaagg ggacctgggg

241 gtgcctgggc tgctaaagtg atcagtaacg ccagagagac tattcaggga atcacagacc

301 ctctgtttaa gggtatgacc agggaccagg tacgggagga ttcgaaggcc gaccagtttg

361 ccaacgaatg gggccggagc ggcaaagacc ccaaccactt cagacctgct ggcctgcctg

421 acaagtactg agctgcctct ctctctgctc aggagatggg ctgtgagtcc ctaagggcag

481 agacactgac ctagagagtt ctctgtcctc agaaggcagc agatctaata aatgctcaag

541 agatgg

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