普通小麦中维生素B6含量的高效液相色谱测定方法与流程

本发明涉及一种普通小麦中维生素b6含量的高效液相色谱测定方法。

背景技术：

小麦是世界第二大粮食作物，在全球各地广泛种植。我国是小麦生产和消费量最大的国家，2016年小麦种植面积达到24186.5千公顷，总产量约为1.29亿吨。随着经济和社会的发展，消费者的生活需求正在发生变化，小麦营养品质备受关注。b族维生素是维持人体生命活动必需的一类有机物质，特别是维生素b6与心血管疾病和老年痴呆疾病紧密相关，其也是人体免疫系统、脂肪酸代谢、基因表达、激素调控及烟酰胺形成的重要调控因子。由于人类和动物自身不能合成维生素b，必须从外界摄取，而谷类食物既富含维生素b族成分又是人们重要的日常食物来源，因此准确测定小麦面粉中维生素b6的含量对评价小麦营养价值及品质育种具有重要的指导性意义。

现阶段，维生素b6的检测方法包括国际上的微生物法和国标的荧光分光光度计法。其中，微生物法定量结果准确，但前处理步骤繁琐，培养时间长，技术难度大，重复性差；荧光分光光度计法操作简单，但由于谷物中维生素b含量较低，有共存物质干扰，所以检测结果重复性不高。鉴于人们对于b6的深入研究，此类方法已不能满足研究者的要求。目前，液相色谱法因其分离效率高、速度快、检测灵敏度高、载液流速快、重复性好、对环境污染小、受环境条件影响小等优点被广泛使用。国内测定麦类作物中b6含量的研究已有报导，但不同研究者方法不尽相同，提取方法和色谱条件是影响测定结果的重要原因。

提取方法是定量分析的最重要的环节，提取溶剂及方法会影响终产物的产量和质量，进而干扰后续的定量分析。目前，对维生素b族成分的提取因试验材料和仪器不同而没有统一的提取标准。韩豪等提取黑小麦中维生素b6时，对黑小麦使用脱脂处理，样品用量大；王海燕等通过高峰淀粉酶法提取彩色小麦中维生素b6，操作复杂，需精确调节每个样品的酸碱度，对大批量样品测定费时费力。同时上述方法需要在加热条件下操作完成，但小麦中淀粉含量较高，高温会使淀粉糊化而降低维生素的溶出率。

高效液相色谱(hplc)技术能对维生素进行快速、灵敏、准确的测定，并通过改变检测器和检测波长提高仪器灵敏度。大量研究利用hplc技术测定蔬菜、水果、肉类、饮料及乳制品中的维生素含量，但普通小麦中维生素b6的测定研究较少。匙赢赢等利用hplc结合紫外检测器测定麦麸中维生素b6的含量，由于受基体干扰，紫外检测器检测时会出现灵敏度和选择性下降等问题。

目前，我国对维生素b的定量研究主要集中于彩色小麦，其分析样本量较少，没有统一的测定标准，无法为普通小麦维生素b含量的分析打下基础。因此，确立高效准确的维生素b6提取和检测方法，可以为普通小麦维生素b的遗传研究提供可靠的表型鉴定方法。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供普通小麦中维生素b6的提取方法。

本发明所提供的普通小麦中维生素b6的提取方法，包括如下步骤：

将普通小麦粉制成全麦粉，在乙醛酸水溶液和硫酸亚铁水溶液存在的条件下，所述全麦粉在醋酸钠水溶液中进行酶解；所述酶解结束后的体系经过滤后的滤液进行衍生化，然后加入乙酸振荡后离心，取上清液，即得到维生素b6。

所述维生素b6的提取方法中，所述酶解采用复合酶，所述复合酶可为木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶、α-淀粉酶和还原性谷胱甘肽的复合物。

所述复合酶的用量为：所述全麦粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶、所述α-淀粉酶的质量比为2.5g：0.05～0.1g：0.01～0.02g：0.005～0.01g，所述全麦粉与所述还原性谷胱甘肽的用量比为2.5g：250～500μl；

所述全麦粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶、所述α-淀粉酶的质量比具体可为2.5g：0.05g：0.01g：0.005g，所述全麦粉与所述还原性谷胱甘肽的用量比具体可为2.5g：250μl。

所述木瓜蛋白酶的酶活为6000u/mg(如北京索莱宝科技有限公司提供的木瓜蛋白酶，货号为ls003126)，所述酸性磷酸酶的酶活≥0.4u/mg(如sigma-aldrich公司提供的酸性磷酸酶，产品目录号为p3627)，所述α-淀粉酶的酶活为30u/mg(如sigma-aldrich公司提供的α-淀粉酶，产品目录号为10065)。

所述酶解可采用恒温酶解的方式，温度可为36～38℃，具体可为37℃，时间可为16～18h，具体可为18h，可在转速为180rpm的条件下进行。

所述维生素b1的提取方法中，所述醋酸钠水溶液的ph值可为4.50～4.52；

所述全麦粉与所述醋酸钠水溶液的质量体积比为2.5～5g：25～50ml，具体可为2.5g：25ml。

所述乙醛酸水溶液的摩尔浓度可为1m，所述硫酸亚铁水溶液的质量分数可为2％；

所述全麦粉与所述乙醛酸水溶液的用量比可为1g：0.5ml；

所述全麦粉与所述硫酸亚铁水溶液的用量比可为1g：80μl。

所述维生素b6的提取方法中，所述衍生化采用的衍生化试剂可为硼氢化钠水溶液；

所述硼氢化钠水溶液的摩尔浓度具体可为0.1m；

所述滤液、所述硼氢化钠水溶液与所述乙酸的体积比可为10：9：1；

所述离心在如下条件下进行：

温度可为2～8℃，具体可为4℃；

转速为4000～4500×g，具体可为4400×g；

时间可为10～15min，具体可为12min。

本发明提取方法中，所述全麦粉采用旋风式粉碎磨。

本发明的第二个目的是提供普通小麦中维生素b6含量的测定方法。

本发明所提供的普通小麦中维生素b6含量的测定方法，包括如下步骤：

(1)制作标准曲线

1)配制至少3种(如5种)不同浓度的维生素b6标准品的水溶液；

2)将所述维生素b6标准品的水溶液进行如普通小麦中维生素b6的提取方法中所述衍生化和所述离心步骤，得到的上清液过醋酸纤维膜得到维生素b6标准品溶液；

3)将所述维生素b6标准品溶液进行高效液相检测，得到不同浓度所述维生素b6标准品溶液的峰面积，以所述峰面积为横坐标，以所述维生素b6标准品溶液的浓度为纵坐标，制作标准曲线；

(2)测定普通小麦中维生素b6的含量

按照普通小麦中维生素b6的提取方法得到的维生素b6过所述醋酸纤维膜后进行所述高效液相检测，得到所述维生素b6的峰面积，根据所述标准曲线，并经折算后即得到所述普通小麦中维生素b6的含量；

所述高效液相检测的条件如下：

色谱柱：watersxterrarp18色谱柱；

流动相：a相为甲醇，b相为含有5mm庚烷磺酸钠的摩尔浓度为0.05m的磷酸二氢钾溶液，所述a相与所述b相的体积比为3：97，用磷酸调ph为2.5；洗脱方式为等度洗脱；柱温为：35℃；进样体积为20μl；流速为0.7ml/min。

按照本发明提供的普通小麦中维生素b6的提取方法提取得到的维生素b6，需在提取后的24小时内完成维生素b6含量的测定工作。

小麦中维生素b6前处理的好坏直接影响最终测定结果，不同植物中维生素b6提取方法不同。本发明通过比较不同处理间试验结果得出：采用高峰淀粉酶法和混合酶法提取，通过比较维生素b6的提取效率，最终选择混合酶法。选取醋酸钠作为提取液，混合酶提取，该法相比高峰淀粉酶法操作更加简单，无需加热和精确调节每个样品的酸碱度，减少提取时间，且避免加热淀粉糊化而降低维生素的溶出率，也更适合大量小麦样品中维生素b6的提取。

本发明中采用hplc搭配荧光检测器，灵敏度更高，选择性更强。维生素b6以吡哆胺和吡哆醛的形式存在，添加乙醛酸和硫酸亚铁将吡哆胺转化为吡哆醛，吡哆醛还原生成吡哆醇，其在紫外光激发下产生稳定荧光，可用于荧光检测器检测。通过高效液相色谱仪确定维生素b6的色谱条件，其中维生素b6的保留时间为9.780min。

附图说明

图1为标准样品中维生素b6色谱图。

图2为本发明实施例1所绘制的标准样品中维生素b6浓度和峰面积之间的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用试剂：甲醇，色谱纯；正丁醇，分析纯；盐酸，分析纯；醋酸，分析纯；醋酸钠，分析纯；硫酸亚铁，分析纯；硼氢化钠，分析纯；铁氰化钾，分析纯；磷酸二氢钾，分析纯；磷酸，分析纯。

下述实施例中，木瓜蛋白酶的酶活为6000u/mg，酸性磷酸酶的酶活为≥0.4u/mg，α-淀粉酶的酶活为30u/mg。

下述实施例中所用维生素b6标准品、高峰淀粉酶、α-淀粉酶、酸性磷酸酶、还原型谷胱甘肽、乙醛酸、庚烷磺酸钠购于sigma公司，木瓜蛋白酶购于索莱宝生物科学有限公司。

本发明小麦中维生素b6的提取方法，所述提取液是按如下方法确定的：选用中优206小麦品种为试验材料，2种提取方法，具体为盐酸和高峰淀粉酶(记为单酶法)；醋酸钠和木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶、α-淀粉酶、还原性谷胱甘肽混合使用(记为混合酶法)，比较不同提取方法对试验材料中维生素b6的提取量多少与方法的稳定性。每个处理重复3次，维生素b6的含量用平均值±相对标准偏差表示。结果显示，单酶法提取维生素b6的含量为2.29μg/g±3.9％，混合酶法提取维生素b6的含量为5.81μg/g±1.2％，混合酶法提取b6的含量比单酶法提取含量高，且总体相对标准偏差均较低。这说明用醋酸钠结合混合酶提取方法重复性更好。此外，该方法操作简单，无需加热，通过醋酸钠处理，变性蛋白质，释放维生素，并将淀粉等多糖转化为单糖；混合酶处理将维生素脱磷酸化转化为自由态，提取更彻底。

实施例1：30份普通小麦中维生素b6含量的测定

一、普通小麦中维生素b6的提取

(1)小麦籽粒收获后，晒干，采用旋风磨制粉，充分混匀后将磨好的粉状样品(即全麦粉)于-20℃条件下避光保存。

(2)称取小麦粉2.5g于100ml的蓝盖试剂瓶中，加入25ml醋酸钠溶液(0.05m，ph4.5)，盖紧盖子，放在混旋器上混合，使粉状样品充分湿润。

(3)将混合后的粉状样品分别加入1m乙醛酸(1.25ml)，2％硫酸亚铁溶液(200μl)，木瓜蛋白酶(50mg)，1％还原型谷胱甘肽水溶液(250μl)，酸性磷酸酶(10mg)，α-淀粉酶(5mg)，每次添加酶后充分混匀。

(4)将混合后的粉状样品置于恒温振荡器中，180rpm，37℃，酶解18h。

(5)振荡完成后，放置室温。转移至50ml的容量瓶中用超纯水定容，滤纸过滤。

(6)取1ml滤液放入10ml的离心管中，加入0.9ml的硼氢化钠溶液(0.1m)，摇匀，静置5min。

(7)再加0.1ml乙酸，振荡，4℃，4400×g离心12min，吸取上层清液，过滤0.45μm的醋酸纤维膜，用于维生素b6的色谱测定。

2、小麦中维生素b6含量的测定

(1)依据如下色谱条件进行hplc检测：

仪器：岛津lc-2010系统，配备rf10axl荧光检测器；

色谱柱：watersxterrarp18(150×4.6mm，5μm)高效液相色谱柱；

流动相：甲醇-0.05m磷酸二氢钾溶液(含5mm庚烷磺酸钠)，体积比为3:97，用磷酸调ph为2.5；洗脱方式为等度洗脱；

柱温：35℃；样品室温度：4℃；

激发波长/发射波长：290nm/395nm；

进样体积：20μl。

(2)测试数据处理：工作站软件为labosolutions；

根据维生素b6标准样品的保留时间(如附图1所示)确定小麦中维生素b6的出峰时间，根据如下步骤分别制作标准样品中维生素b6浓度和峰面积之间的标准曲线：

1)配制5种不同浓度的维生素b6标准品的水溶液；

2)将维生素b6标准品的水溶液进行上述小麦中维生素b6的提取方法中的衍生化和所述离心步骤(具体条件相同)，得到的上清液过0.45μm醋酸纤维膜得到维生素b6标准品溶液；

3)将维生素b6标准品溶液进行高效液相检测，得到不同浓度维生素b6标准品溶液的峰面积，以峰面积为横坐标，以维生素b6标准品溶液的浓度为纵坐标，制作标准曲线，如图2所示。

然后将已测30份小麦样品的峰面积数据代入标准曲线(图2)，即可得到维生素b6含量。

30份普通小麦中，维生素b6含量变异范围从4.58到9.34μg/g，平均值为6.77μg/g。30份小麦样品中维生素b6的含量如下表1所示，小麦品种全部来源于黄淮麦区，每个品种两次重复，取其平均值。

表130份普通小麦维生素b6含量