快速溶剂萃取联合QuEChERS净化法测定理肺丸中盐酸麻黄碱的方法与流程

本发明涉及一种测定理肺丸中盐酸麻黄碱的方法，尤其是一种快速溶剂萃取联合quechers净化法测定理肺丸中盐酸麻黄碱的方法，属于化学检测
技术领域：
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背景技术：
：通宣理肺丸是由紫苏叶、前胡、桔梗、苦杏仁、麻黄、甘草、陈皮、半夏等十一味中药材组方制成的丸剂，味微甜、略苦，具有解表散寒,宣肺止嗽的功能，用于风寒束表、肺气不宣的感冒咳嗽，症见发热、恶寒、鼻塞流涕、头痛、无汗、肢体酸痛。其中麻黄具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的作用,用于风寒感冒、胸闷喘咳、风水浮肿，其主要有效成分为盐酸麻黄碱。中国药典2015年版一部规定通宣理肺丸中含量测定的成分为盐酸麻黄碱。快速溶剂萃取(ase)是指在密闭容器内于高温(50～200℃)和高压(500～3000psi)条件下，在短时间内，用有机溶剂提取固体或半固体样品的一种新型样品前处理方法。与超声、微波、回流、超临界萃取等成熟方法相比，ase有萃取溶剂用量少、提取时间短、萃取效率高、操作简单方便、安全和自动化程度高等优点。国外已有学者将这项技术应用于植物药定量和定性分析中样品的前处理，但在中成药有效成分的定量和定性分析中作为样品的前处理方法应用较少，用于通宣理肺丸中盐酸麻黄碱提取的研究未见报道。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种节约提取时间，检测结果准确可靠的快速溶剂萃取联合quechers净化法测定理肺丸中盐酸麻黄碱的方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样的：一种快速溶剂萃取联合quechers净化法测定理肺丸中盐酸麻黄碱的方法，依次包括下述步骤：1)对照品储备液的制备精密称定盐酸麻黄碱对照品19.77mg，用盐酸甲醇溶液定容至50ml量瓶中，制成0.3942mg·ml-1的对照品储备液2)准确称取样品1g置于10ml萃取池中，用正己烷对样品进行除酯提取温度为80℃，静态提取时间为5min，提取次数为1次，冲洗体积100％)后以甲醇为提取溶剂，提取温度为80℃，静态提取时间为8min，提取次数为3次。提取完成后将提取液定容至25ml，吸取1.5ml于装有300mgpsa的2ml离心管中，漩涡2min，离心力25700×g离心3min，取上清液进行高效液相分析。进一步的，上述的一种快速溶剂萃取联合quechers净化法测定理肺丸中盐酸麻黄碱的方法，所述的色谱条件为：分析柱aceexcel2c18-pfp流速0.5ml·min-1，柱温35℃，检测波长210nm，进样量为1μl；流动相a为乙腈，流动相b为0.1％磷酸溶液；梯度洗脱程序：0～3.5min，2％a、98％b；3.5～4min，2％～90％a、98％～10％b；4～7min，90％a、10％b；在2％a、98％b下平衡2min。进一步的，上述的一种快速溶剂萃取联合quechers净化法测定理肺丸中盐酸麻黄碱的方法，所述的除酯条件是提取温度为80℃，静态提取时间为5min，提取次数为1次，冲洗体积100％。本发明与现有技术相比，具有以下优势：本发明提供的技术方案ase法极大限度地节省了提取时间，由原来的48h以上，缩短为40min，且省略了繁琐的萃取净化步骤及挥干的过程，减少了盐酸麻黄碱在提取和后处理中的降解及损失，保证结果的可靠性。快速溶剂萃取法(ase)提取通宣理肺丸中盐酸麻黄碱可行，适用于通宣理肺丸中盐酸麻黄碱的提取。附图说明图1是对照品hplc色谱图；图2是供试品hplc色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限制，任何对本发明做有限次修改可得的技术方案仍然属于本发明所要保护的范围。实施例11仪器与试药ase350快速溶剂萃取仪(美国thermofisher公司)；ultimate3000dglc，dad检测器，二元梯度泵，自动进样器(美国thermofisher公司)；xa205du电子天平(瑞士梅特勒公司)；3k15高速离心机(德国sigma)；classicuvf超纯水器(英国elga)。盐酸麻黄碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：171241-201007)；乙腈(色谱纯，德国merck公司)，其余试剂均为分析纯；通宣理肺丸(大蜜丸，由广西梧州三鹤药业有限公司，批号：140201、140803、140850、150901、150702)。2方法与结果2.1盐酸麻黄碱的测定2.1.1色谱条件分析柱aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)，流速0.5ml·min-1，柱温35℃，检测波长210nm，进样量为1μl。流动相a为乙腈，流动相b为0.1％磷酸溶液；梯度洗脱程序：0～3.5min，2％a、98％b；3.5～4min，2％～90％a、98％～10％b；4～7min，90％a、10％b；在2％a、98％b下平衡2min。见图1。2.1.2对照品储备液的制备精密称定盐酸麻黄碱对照品19.77mg，用盐酸甲醇溶液(1→1000)定容至50ml量瓶中，制成0.3942mg·ml-1的对照品储备液。2.1.3供试品溶液制备2.1.3.1快速溶剂萃取法准确称取样品1g置于10ml萃取池中，用正己烷对样品进行除酯(提取温度为80℃，静态提取时间为5min，提取次数为1次，冲洗体积100％)后以甲醇为提取溶剂，提取温度为80℃，静态提取时间为8min，提取次数为3次。提取完成后将提取液定容至25ml，吸取1.5ml于装有300mgpsa的2ml离心管中，漩涡2min，离心力25700×g离心3min，取上清液进行高效液相分析。2.1.3.2索氏提取法准确称取样品2g，加硅藻土2g，研磨均匀。置索氏提取器中，加浓氨试液3ml、乙醇10ml与乙醚适量，置水浴上加热回流至提取液无色，放冷，将乙醚提取液移至蒸发皿中，滤纸和容器用少量乙醚洗涤，洗液并入蒸发皿中，挥干，残渣用盐酸甲醇溶液(1→1000)溶解，转移至10ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液(1→1000)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液进行超高效液相分析。2.1.4线性关系试验精密吸取0.3942mg·ml-1的对照品储备液1ml，用盐酸甲醇溶液(1→1000)定容至25ml量瓶中，制成0.0158mg·ml-1的标准溶液。进样量分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2μl，平行测定2次，以峰面积(y)对质量浓度(x，mg·ml-1)进行线性回归，线性方程为：y＝4184.2x+0.3465，r＝0.9999。表明在0.00315～0.0189mg·ml-1范围内线性关系良好。2.1.5精密度试验取0.0158mg·ml-1的对照品储备液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果盐酸麻黄碱峰面积的rsd为2.7％(n＝6)，说明仪器精密度良好。2.1.6稳定性试验取同一供试品(批号：150702)，按“2.1.3.1”方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0，4，8，12，16，20，24h测定，记录峰面积，结果盐酸麻黄碱峰面积的rsd为3.5％(n＝7)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。2.1.7方法重复性和回收率试验准确称取通宣理肺丸(批号：150702)1g共6份，再准确称取通宣理肺丸(批号：150702)0.5g共6份，精确加入盐酸麻黄碱标准溶液0.3ml(含盐酸麻黄碱0.11826mg)，按“2.1.3.1”方法进行提取及检测。结果重复性rsd为3.0％(n＝6)，加标回收率范围为92％～102％，rsd为4.2％(n＝6)，由于加标方式为将对照液加入装有样品的小烧杯中，混匀，与硅藻土充分分散后再装入萃取池中，整个转移过程可能对加入量有一定的损失。2.2快速溶剂萃取(ase)方法优选2.2.1单因素考察取批号为150702作为考察样品，考察提取溶剂、提取温度、提取时间、提取次数等因素对通宣理肺丸中盐酸麻黄碱提取效率的影响。以盐酸麻黄碱含量为评价指标。2.2.1.1提取溶剂和取样量的选择准确称取通宣理肺丸样品2g，分别用正丁醇、乙酸乙酯、氨水-正丁醇、氨水-乙酸乙酯、氨水-乙醇-乙酸乙酯(3:10:90)、1.44％磷酸、碱性甲醇(ph8～9)、甲醇作为提取溶剂，在100℃下萃取5min，萃取3次，考察不同提取溶剂对盐酸麻黄碱提取效果的影响。结果显示，磷酸或碱性甲醇提取效率较高，但基质影响较大；氨水-乙醇-乙酸乙酯(3:10:90)条件下提取效率较高且基质影响较小，但考虑酸、碱溶剂对ase仪器的影响，故选择甲醇作为提取溶剂。由于使用使用的10ml萃取池溶剂冲洗体积有限，2g样品提取不充分，因此选择取样量为1g。2.2.1.2提取温度的选择准确称取通宣理肺丸样品1g，用甲醇作为提取溶剂，在80℃、100℃、120℃下分别提取3次，每次8min，考察不同提取温度对盐酸麻黄碱提取效果的影响。结果80℃、100℃、120℃下ase方法所得到的提取率较药典提取方法偏低，可能盐酸麻黄碱受热易降解，考虑降低温度以提高提取效率。由于甲醇的沸点约为64℃，结合ase的高压穿透性，故选择70℃、80℃和90℃对提取方法进行摸索，考察提取温度对通宣理肺丸中盐酸麻黄碱的提取效率影响。准确称取通宣理肺丸1g，用甲醇作为提取溶剂，在70℃、80℃和90℃下分别提取3次，每次8min，考察不同提取温度对盐酸麻黄碱提取效果的影响。结果见表1。表1不同提取温度对盐酸麻黄碱的提取效果表1可见，温度对提取效率的影响较大。在考虑盐酸麻黄碱的提取效率时，应充分考虑其高温降解的影响及其所使用溶剂的熔沸点。根据选择的提取溶剂甲醇可确定温度在80℃左右，进一步优化提取温度与提取时间、循环次数、杂质净化等因素，寻求最佳方案。2.2.2ase提取正交试验结果根据单因素试验的结果，确定甲醇为提取溶剂，采用l9(34)正交试验，以提取温度(a，℃)、提取时间(b，min)和提取次数(c，次)这3个因素对通宣理肺丸中盐酸麻黄碱提取含量的影响，每个因素三个水平，进行ase法提取通宣理肺丸中盐酸麻黄碱的条件优化。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。表2l9(34)正交试验表及结果分析表3方差分析由正交试验结果可知，影响通宣理肺丸中盐酸麻黄碱ase提取效果的各因素主次顺序为：c(提取次数)>b(提取时间)>a(提取温度)，得到最佳提取条件为：a2b2c2，即称样量为1g，甲醇作为提取溶剂，提取温度为80℃，提取时间为8min，提取次数3次。2.3ase法与药典方法比较分别取通宣理肺丸5个批次样品，每个批次分别取3份，按“2.1.3.1”项下ase方法进行仪器1和仪器2的处理；取通宣理肺丸5个批次样品，每个批次分别取2份，按”2.1.3.2”项下药典方法处理，分别进液相进行分析。结果如表4。表4不同仪器验证及ase法与药典方法的平均含量(单位：mg/丸，n＝3)批号ase法(仪器1)ase法(仪器2)药典方法1402011.901.861.901408031.841.811.771408502.022.011.701509011.901.951.841507021.341.311.39两台ase仪器得到的通宣理肺丸中盐酸麻黄碱含量rsd均少于5％，表明方法的重复性好。由以上5批样的结果分析可见，药典方法由于受到环境温度，回流速率、时间，加液体积，包装紧密等多种因素的影响，同批样品同一时间提取，差异性较大，重现性较差。采用优化后的ase法提取通宣理肺丸中盐酸麻黄碱，结果重复性较好，提取较完全，与药典方法的rsd在5％以内,数据分别为1.1％、0.9％、0.3％、1.3％、1.2％,，0.6％、1.6％、4.3％、2.3％、2.4％可控性强。3讨论3.1液相色谱条件的选择中国药典2015年版一部中使用0.02mol·l-1磷酸二氢钾(含0.2％三乙胺，磷酸调节ph至2.7)作为水相流动相，考虑到使用缓冲盐以及调节流动相酸度的不便，尝试用0.1％磷酸作为水相流动相，分别采用phenomenexsynergipolar-rp80a(250mm×4.6mm，4μm)、agilentzorbaxsbc18(250mm×4.6mm，5μm)、thermoaccucorec18(2.1mm×50mm，2.6μm)、aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)进行实验，发现aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)分离效果最好、色谱峰形理想，故选用aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)为分析柱。3.2杂质净化方法由于样品通宣理肺丸为大蜜丸，在中国药典中盐酸麻黄碱[1]使用了氨化乙醚进行提取，同时去除了糖类等杂质的干扰，若以甲醇作为快速溶剂萃取方法的提取溶剂，处方中极性小的酯类成分以及丸剂中糖类杂质溶出较多，基质对盐酸麻黄碱液相分析干扰较大，需要前处理去掉相应的杂质干扰。3.2.1小极性杂质净化方法考察由于乙醚不能适用于ase法，尝试用正己烷对样品进行预处理，提取温度为80℃，静态提取时间为5min，提取次数为1次，冲洗体积100％，结果发现部分小极性脂类物质被去除，且盐酸麻黄碱在此条件下没有损失。3.2.2糖类杂质净化方法考察尝试在萃取池底部填充一定量的净化材料，如硅胶、中性氧化铝、碱性氧化铝、c18、psa(n-丙基乙二胺)等，在提取的过程中直接净化样品。结果发现硅胶、c18净化效果较差，中性氧化铝、碱性氧化铝的净化效果较好，随着氧化铝的增加，净化效果越好，但中性氧化铝和碱性氧化铝对目标化合物对盐酸麻黄碱有一定吸附作用，损失率约为15％～18％。psa(n-丙基乙二胺)吸附糖类物质效果较好，且基本没有损失，但考虑到在萃取池中直接加psa的量较大，成本较高，故改用quechers净化方法。即对ase萃取液定容至25ml后，吸取1.5ml于装有一定量psa的2ml离心管中，漩涡2min，离心力25700×g离心3min，取上清液进行高效液相分析。3.2.3净化量考察分别吸取1.5mlase萃取液置于装有50，100，200，300，400，500mgpsa的2ml净化管中，漩涡2min，15000r·min-1离心3min后取上清液进行分析。结果发现300mgpsa净化效果最好，故确定psa的净化量为300mg。总而言之，优化后的ase法极大限度地节省了提取时间，由原来的48h以上，缩短为40min，且省略了繁琐的萃取净化步骤及挥干的过程，减少了盐酸麻黄碱在提取和后处理中的降解及损失，保证结果的可靠性。快速溶剂萃取法(ase)提取通宣理肺丸中盐酸麻黄碱可行，适用于通宣理肺丸中盐酸麻黄碱的提取。以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12