本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法。
背景技术：
葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphateisomerase，gpi;ec5.3.1.9)是一类具有多功能生物活性的天然蛋白质，它参与糖代谢的磷酸戊糖途径和糖酵解作用，催化葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，g-6-p)和果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate，f-6-p)的相互转化，从而催化f-6-p异构化为g-6-p。
李属蔷薇科李亚科李属植物，全世界广泛栽培，其中中国李是栽培种中最大的一个种。李酸甜适度，风味极佳。研究表明李果实发育的早期，果糖和葡萄糖含量较低，而蔗糖含量相对较高；果糖和蔗糖随着果实的发育成熟呈逐渐下降的趋势。随着果实的发育，葡萄糖增加显著，成为主要的可溶性糖。经测定，李果实中gpi活性与葡萄糖含量显著正相关，与果糖含量呈显著负相关。因此能准确有效地测定出果实中gpi的活性变化，是探讨糖转化、积累的关键指标。
目前关于gpi活性的研究主要集中在人和动物上，植物上研究较少。本实验采用分光光度计法测定李果实中gpi活性，建立的方法准确可靠，简便快捷，是一种测定李果实gpi活性的有效途径，可为李成熟果实果糖转化为葡萄糖提供理论依据。
技术实现要素：
本发明提供一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法，该方法准确可靠，简便快捷，是一种测定李果实gpi活性的有效途径。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法，包括以下步骤：对照ck的测定，样品提取液制备，脱盐，酶促反应，gpi活性计算。
其中，所述酶促反应的酶为6-磷酸葡萄糖脱氢酶，己糖激酶以及蔗糖转化酶。
其具体步骤为：
（1）对照ck的测定：蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖和果糖，葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下脱氢引起吸光值变化abs1=（a1ck-a0ck）；
（2）样品提取液的制备：取0.15g冷冻的李果肉样品，用1.6ml提取液研磨至匀浆；
（3）脱盐：提取完成后4℃，12000g下离心20min，取上清液过g25脱盐柱，收集脱盐产物；
（4）酶促反应：取脱盐产物100ul于800ul反应体系测定，该反应体系含100mmph为6.9的咪唑-hcl，5mmmgcl2，0.5mmnad，1mmatp，100ul提取液，2u6-磷酸葡萄糖脱氢酶，2u己糖激酶，2u蔗糖转化酶，以加入10mm的蔗糖起始反应，于340nm处检测吸光值的变化abs2=（a1-a0）；
（5）gpi活性计算：利用公式gpi=n·(abs2-abs1)/(6.22·w·t)计算gpi活性，其活性单位为nmol·g-1·s-1；其中，n为稀释倍数，6.22为吸光系数w为样品质量，t为反应时间。
其中，所述步骤（2）或（4）中的提取液成分为50mmph为7.5的hepes–koh缓冲液，2mmedta，10mmmgcl2，10mm二硫苏糖醇（dtt），1%(w/v)曲拉通x-100，30%(w/v)甘油，1%(w/v)牛血清蛋白（bsa），5%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮（pvpp），和1mm苯甲磺酰氟（pmsf）。
本发明的有益效果：该方法具有分析速度快，准确度高，重现性好，精密度高，稳定性好等优点，是一种测定李果实中gpi活性的理想方法，并可为其他李属果实gpi活性的测定提供参考依据。
附图说明
图1芙蓉李果实不同发育时期gpi活性变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种分光光度计测定李果实中磷酸葡萄糖异构酶活性的方法，本发明领域技术人员可借鉴本发明，适当改进工艺参数，所有类似的替换和改动都视为本发明。下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为商业途径获得。下述实施例中所用试验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。
实施例1
应用分光光度计法测定芙蓉李果实不同生长发育时期磷酸葡萄糖异构酶（gpi）的活性，包括以下步骤：
（1）对照ck的测定：蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖和果糖，葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下脱氢引起吸光值变化abs1=（a1ck-a0ck）；
（2）样品提取液的制备：取0.15g冷冻的李果肉样品，用1.6ml提取液研磨至匀浆；提取液成分为50mmph为7.5的hepes–koh缓冲液，2mmedta，10mmmgcl2，10mm二硫苏糖醇（dtt），1%(w/v)曲拉通x-100，30%(w/v)甘油，1%(w/v)牛血清蛋白（bsa），5%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮（pvpp），和1mm苯甲磺酰氟（pmsf）；
（3）样品中磷酸葡萄糖异构酶gpi活性的测定：提取完成后4℃，12000g下离心20min，取上清液过g25脱盐柱，收集脱盐产物；取脱盐产物100ul于800ul体系测定，该反应体系含100mmph为6.9的咪唑-hcl，5mmmgcl2，0.5mmnad，1mmatp，100ul提取液，2u6-磷酸葡萄糖脱氢酶，2u己糖激酶，2u蔗糖转化酶，以加入10mm的蔗糖起始反应，于340nm处检测吸光值的变化abs2=（a1-a0）；
（4）gpi活性计算：利用公式gpi=n·(abs2-abs1)/(6.22·w·t)计算gpi活性，其活性单位为nmol·g-1·s-1；其中，n为稀释倍数，6.22为吸光系数w为样品质量，t为反应时间。
所得gpi结果如图1所示，从图中可以看出，芙蓉李果实中gpi活性随果实成熟度的增加而增大，其后期gpi活性增大显著。
实施例2方法学考察
（1）精密度试验
取标准品gpi（sigma）配置成0.5u/μl的浓度，按照上述方法进行测定6次，计算相对标准偏差（relativestandarddeviation,rsd）。试验结果见表1，结果表明，本实验测定结果准确，仪器精密度较高，rsd控制在1.03%左右。
表1精密度试验
（2）重复性试验
提取不同时期的芙蓉李果实，根据上述步骤1的要求提取果实中的酶液，根据步骤3的方法测定酶活性，结果如表3所示，各个时期的相对标准偏差rsd控制在2.08%-8.25%之间，说明试验重复较好。
表3芙蓉李果实不同生长发育时期gpi测定