基于适体和金磁纳米颗粒的细胞因子TNF‑α的检测方法与流程

本发明涉及一种细胞因子tnf-α的检测方法，特别涉及一种基于适体和金磁纳米颗粒的细胞因子tnf-α的检测方法。

背景技术：

肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)是血清中出现的一种能使多种肿瘤发生出血性坏死的蛋白。tnf主要由活化的巨噬细胞，nk细胞及t淋巴细胞产生。1985年shalaby把巨噬细胞分泌的tnf命名为tnf-α。tnf-α是一种小分子蛋白，与特异受体结合后可发挥多种生物学效应，包括免疫激活、炎症反应、细胞生长相关基因激活表达、杀伤或抑制肿瘤细胞等。究表明，tnf-α可明显增加肝脏细胞的损伤并导致肾脏损害，降低肝硬化伴自发性腹膜炎患者的预后并显著升高死亡率。tnf-α拮抗治疗可持续改善某些疾病的病变。此外，有研究者发现，eb病毒感染可导致机体表达tnf-α明显升高。以上研究结果均证明tnf-α与机体炎症反应的密切关系。现有的检测方法包括生物学检测法(利用tnf敏感的靶细胞测定tnf活性，根据细胞死亡得出tnf的相对活性)、免疫学检测法(elisa)等。生物学检测法涉及敏感特异靶细胞的选择和培养，操作复杂；免疫学检测法需用到抗体，价格较为昂贵。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本案提供一种基于适体和金磁纳米颗粒的细胞因子tnf-α的电化学检测方法。

为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：

一种基于适体和金磁纳米颗粒的细胞因子tnf-α的检测方法，其包括：

1)以磁性玻碳电极作为工作电极，对磁性玻碳电极进行预处理；

2)将金修饰于fe3o4纳米颗粒，制得金磁纳米颗粒；

3)将dna探针1修饰于所述金磁纳米颗粒表面；

4)将dna探针2与所述金磁纳米颗粒表面的dna探针1进行杂交反应，以在所述金磁纳米颗粒表面形成互补配对的dna双链；

5)将所述金磁纳米颗粒通过磁场作用吸附于所述磁性玻碳电极表面；

6)将所述磁性玻碳电极插入待测液中进行反应，并采集相应电化学响应值，根据电化学响应值与细胞因子tnf-α浓度的对应关系，获得待测液中细胞因子tnf-α的浓度；

其中，所述dna探针1的序列为5’-sh-ttttttttgtcgccgactgcgccatc-3’；

所述dna探针2的序列为5’-mb-tggtggatggcgcagtcggcgacaa-3’；其中，mb为电信号分子亚甲基蓝。

dna探针1的5’端修饰有巯基，可以与金表面发生共价键合，dna探针2的序列含有待测tnf-α的适体序列，且其5’端修饰有亚甲基蓝(mb)这一电信号分子。本案合成了fe3o4@au复合纳米颗粒，并将dna探针1修饰与其表面，接着通过两段dna之间的互补配对，在复合纳米颗粒表面组装了dna双链。

使用磁性玻碳电极将上述材料吸附于电极表面，此时检测电化学响应，由于存在大量的亚甲基蓝，会出现较大的峰电流(方波伏安法)。加入待测样本后，其中的tnf-α会与dna探针2结合，使得双链结构被破坏，dna探针2游离到溶液中，电极表面的亚甲基蓝数量大幅减少，从而获得的峰电流会降低，通过分析降低值，可以实现对tnf-α的定量分析。

优选的是，所述的检测方法，其中，步骤1)中，对磁性玻碳电极进行预处理包括：

将磁性玻碳电极浸泡于水虎鱼洗液中，以除去电极表面吸附的杂质；其中，以体积比为计，所述水虎鱼洗液的组成为98％h2so4∶30％h2o2＝3∶1。

优选的是，所述的检测方法，其中，对磁性玻碳电极进行预处理还包括：将磁性玻碳电极用碳化硅砂纸打磨至呈镜面光滑，随后将磁性玻碳电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗。

优选的是，所述的检测方法，其中，对磁性玻碳电极进行预处理还包括：将磁性玻碳电极用0.5mh2so4溶液清洗，随后用氮气干燥以待后用。

优选的是，所述的检测方法，其中，所述金磁纳米颗粒通过以下制备方法获得：

将fe3o4粉末溶于150ml双蒸水中，超声分散；

将氯金酸加入到fe3o4溶液中，在0℃下搅拌1小时；

将nabh4缓慢加入到上述混合液中，在0℃下反应15分钟；

磁性分离，乙醇清洗3次后在50℃下真空干燥得金磁纳米颗粒。

优选的是，所述的检测方法，其中，步骤3)中，dna探针1的修饰方法为：将金磁纳米颗粒溶于双蒸水中，加入dna探针1，放置16小时后使用老化液进行老化；1天后通过磁性分离除去液体，使用含有0.25mnacl的10mm磷酸缓冲液清洗和复溶；其中，所述老化液是含有0.1mkno3的10mm磷酸缓冲液。

本发明的有益效果是：本案用于检测tnf-α具有灵敏度高、快速、成本低的特点，检测限为1ngml^-1，通过设计的特异性适体和电化学技术的结合，可以实现tnf-α生物传感的应用；通过引入金磁复合纳米材料，不仅可用于适体的固定，还可实现电极的循环使用。

附图说明

图1为fe3o4纳米颗粒和金磁纳米颗粒的扫描电子显微图；其中，(a)为fe3o4纳米颗粒的扫描电子显微图，(b)为金磁纳米颗粒的扫描电子显微图。

图2为玻碳电极不同修饰阶段的交流阻抗图：(a)金磁纳米颗粒，(b)金磁纳米颗粒与dna探针1的复合物，(c)金磁纳米颗粒-dna双链，(d)金磁纳米颗粒-dna双链与tnf-α发生作用后。

图3为玻碳电极不同修饰阶段的方波伏安图：(a)金磁纳米颗粒，(b)金磁纳米颗粒与dna探针1的复合物，(c)金磁纳米颗粒-dna双链，(d)金磁纳米颗粒-dna双链与tnf-α发生作用后。

图4中(a)为检测不同浓度的tnf-α最终呈现的方波伏安图，(b)为tnf-α浓度相对应的方波伏安峰电流值的标准曲线；误差条表示三次独立测量的相对标准偏差。

图5为tnf-α检测量(100ngml^-1)相对于其他的干扰细胞因子(包括il-2，il-12，ifn-γ)的干扰实验结果图。

图6为玻碳电极再生后用于多次检测tnf-α的结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本案列出一实施例的细胞因子tnf-α的检测方法，具体可包括：

1)使用磁性玻碳电极(直径2mm)作为工作电极。电极在修饰前可优选在新配的水虎鱼溶液(98％h2so4：30％h2o2＝3:1)中浸泡5分钟，除去电极表面吸附的物质。

2)用蒸馏水洗干净后，将电极用碳化硅砂纸(3000目)打磨到镜面光滑。然后，将电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗各5分钟。接着，在使用前先在氮气氛围内干燥。

3)处理过的电极用0.5mh2so4溶液进行电化学清洗。然后，将电极用氮气干燥以待进一步修饰。

4)采用水热法合成fe3o4纳米颗粒：1.35g的fecl3·6h2o溶于40ml乙二醇中，搅拌均匀。当溶液澄清后，加入3.6g的醋酸钠。该溶液继续搅拌0.5小时，然后加热到200℃，反应9小时。冷却到室温后，得到黑色沉淀物，通过磁铁分离收集fe3o4纳米颗粒。使用乙醇清洗3次，去除杂质。最后在50℃温度下真空干燥成固体。

5)将15mgfe3o4粉末溶于150ml双蒸水中，超声分散。配制浓度为6mgml^-1的氯金酸3ml，将其加入到上述fe3o4溶液中，保持0℃温度，搅拌1小时。然后配制浓度为0.2m的nabh4溶液0.9ml，缓慢加入到上述混合液中(4分钟加完)。在0℃温度下反应15分钟。溶液颜色由浅棕变为深紫。同样使用磁铁进行分离，使用乙醇清洗3次，去除杂质。最后在50℃温度下真空干燥成固体，得金磁纳米颗粒(fe3o4@au复合纳米颗粒)。

6)将fe3o4@au复合纳米颗粒溶于双蒸水中。配置dna探针1溶液(10mmtris-hcl,1mmedta,10mmtcep,and0.1mnacl)。混合两个溶液，使dna探针1的终浓度达到5μm。该混合物放置16小时后使用老化液(含有0.1mkno3的10mm磷酸缓冲液)进行老化。1天后通过磁铁分离除去多余的试剂，使用含有0.25mnacl的10mm磷酸缓冲液清洗和复溶。该材料再与dna探针2混合进行杂交反应，搅拌反应1小时，即可实现dna探针1与探针2的互补配对。离心纯化后得fe3o4@au复合纳米颗粒-dna双链溶液。

7)将预处理的电极浸入浓度为1mgml^-1的fe3o4@au复合纳米颗粒-dna双链溶液，反应2分钟，然后配制一系列浓度的tnf-α标准液，将修饰的电极进一步浸入上述标准液和待测液中反应半小时。清洗后进行电化学检测。

8)电化学检测均使用计算机控制的chi660d电化学工作站(chinstruments，中国)进行。使用三电极系统，其中，辅助电极为铂电极，饱和甘汞电极作参考电极。交流阻抗谱的缓冲液为含有1mmkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液；方波伏安法的电解液为含有140mmnacl和5mmmgcl2的20mmtris-hcl(ph7.4)。

从图1可以看到，fe3o4纳米颗粒的尺寸约为200nm左右，金磁纳米颗粒表面的亮点为金颗粒。

图2中的交流阻抗用于表征在多步表面修饰过程中[fe(cn)6]^3-/4-的化学性质，阻抗谱的半圆区域代表电荷转移受阻碍的程度。曲线a没有出现该区域，证明fe3o4@au复合纳米颗粒的导电性能良好；曲线b出现了一个较小的半圆区域，是由于fe3o4@au复合纳米颗粒与dna探针1的复合物中的dna骨架的磷酸基团带有的负电荷与[fe(cn)6]^3-/4-之间的排斥作用；曲线c的半圆区域进一步增大是由于复合纳米材料表面形成了dna双链，电负性进一步增大。曲线d的半圆区恢复到曲线b的程度，是由于待测物与dna双链中的一段单链能形成适体-靶蛋白的复合物，从而将双链dna中的一条单链取代下来，使电极表面的修饰物恢复为fe3o4@au复合纳米颗粒-dna探针1。

图3中的方波伏安图的趋势与图2的阻抗图结果一致，dna探针2(待测物适体)上标有的亚甲基蓝这一电信号分子只有在曲线c的情况下才会出现明显的电流峰。

图4中swv峰电流值在5至100ng/ml的范围内显示与tnf-α浓度的的线性关系。回归方程为y＝1.962-0.018x(r²＝0.996，重复次数n＝3)，其中y是峰电流值(μa)，x是tnf-α浓度(ngml^-1)。检测限为1ngml^-1。

图5通过使用一些的干扰细胞分子来验证所提出的tnf-α检测方法的特异性。在tnf-α测定和对照实验之间存在显着的电化学信号差异。因此，实验结果表明tnf-α与适体结合是有效和可靠的，而所有对照分子降低的电流值可以忽略不计，证实了所提出方法的高选择性。

图6通过去除电极磁场，电极界面的反应过的金磁纳米颗粒被释放回溶液中，随后再加上磁场吸附下一轮检测用的金磁纳米颗粒，发现它可用于再生后的新一轮检测。由实验结果可知，多次再生后的电极仍然具有较好的电化学响应。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

dna探针1的序列为5’-sh-ttttttttgtcgccgactgcgccatc-3’；

dna探针2的序列为5’-mb-tggtggatggcgcagtcggcgacaa-3’。