血清中脂蛋白a先后双试剂测定方法与流程

本发明属于一种脂蛋白a免疫比浊测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中脂蛋白a的先后双试剂测定方法。

背景技术：

脂蛋白a(lpa)是心脑血管病的独立危险因素，其在动脉粥样硬化(as)与血栓形成中起着重要的桥梁和纽带作用，lpa具有明显的多态性，由于其结构的特殊性，使得目前测定lpa的不同方法、不同试剂、不同系统之间的结果缺乏可比性，需对其测定进行标准化。测定lpa的免疫化学检测法，如辐射状免疫扩散法(rid)、电免疫扩散法(eid)、放射免疫测定法(ria)、酶联免疫吸附试验(elisa)、免疫浊度法(包括免疫散射比浊法(ina)和免疫透射比浊法(ita)、解离增强配体荧光免疫测定法(delfia)等。rid法与eid法因操作简便，不需特殊设备，仍有一些基层单位实验室采用，但缺点是灵敏度低。ria法的缺点是操作复杂，有放射性核素污染。delfia法因需特殊仪器，国内也较少应用。各种lpa方法测定所得参考值相近，目前国内外所采用的判断标准基本相同。一般认为300mg/l为临界水平，大于300mg/l以上为病理水平，lpa的测定的临床应用价值已引起越来越多研究者的重视。

lpa测定的标准化数次国际性的lpa室间调查表明，不同实验室之间lpa结果差异很大，说明检测质量问题严重，急需进行标准化工作，lpa组成、大小、密度不均一性即lpa的多态性是lpa测定标准化的最大困难之一。试剂盒的分析性能差异、缺乏国际公认的二级参考材料、lpa的报告方式等也是影响lpa标准化的重要因素。

各种血清蛋白、补体、免疫球蛋白、急性反应蛋白、血凝蛋白及尿微量蛋白、lpa等都可在它们的特异性抗体存在下形成抗原(ag)-抗体(ab)复合物。这些免疫复合物可在不加标记的情况下，基于其散射光性质(light-scattering)通过透射比浊(turbidimetry)或散射比浊(nephelometry)方法直接参照标准(校正)物测定。

ag与其特异ab的结合是非共价的，按下述反应定律进行：

ag+ab→agabcomplex

结合常数是k。这种结合力的强弱决定于ag对ab的亲合力，参与结合的作用力包括氢键、范德华力(vanderwaalsbond)和疏水键等。在[ab]一定时，增加[ag]，反应向ag-ab复合物形成方向进行。随着[ag]的增加，在[ab]过量区，随着[ag]增加免疫复合物形成增加，反应浊度升高，直至最高的反应平衡区；此后，进一步增加[ag]将导致沉淀增加，反应浊度反而下降，此为ag过剩区。这三个阶段出现的原因是：大多数ab是双价的(multivalent)。在反应的开始阶段，有较多的ab可被结合到抗原上。因此，ag上的所有结合位点都被ab结合，只有简单的可溶性ag-ab复合物，[agab]可通过光散射的性质被定量，经与标准(校正)物比较求出[ag]，但在临床检验测定中，如何确认抗原浓度过剩而引起的测定结果出现偏差？。

技术实现要素：
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为了解决现有技术中血清中lpa的测定方法存在lpa浓度过高而引起的测定结果出现偏差，本发明提供一种经济方便易行，准确性更高、能够通过实时反应曲线判定血清脂蛋白a测定中过剩的方法。

解决该技术问题采用的技术方案是：采用先后双试剂测定方法，试剂ⅰ和试剂ⅱ均为抗人脂蛋白a抗体试剂，血清中脂蛋白a与脂蛋白a测定试剂中抗体于37℃温浴3～5分钟形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，然后再加入脂蛋白a测定试剂，当反应液中脂蛋白a过剩时，将再次出现反应峰，表明脂蛋白a抗原过剩；当出现平坦曲线时，则表明反应已达到了终点，仪器在334～340nm波长处检测，以第一步反应产生的浊度计算出脂蛋白a的含量。本发明检测时能够判断抗原过剩现象，经济方便易行，是一种准确性更高的脂蛋白a检测方法。

试剂ⅰ各组分浓度为：甘氨酸0.10～0.24mmol/l，氯化钠0.05～0.15mmol/l，包被抗lpa抗体的乳胶颗粒悬浮液2～8％，proclin-300防腐剂100μl～300μl；试剂ⅱ各组分浓度为：甘氨酸0.10～0.24mmol/l，氯化钠0.05～0.15mmol/l，包被抗lpa抗体的乳胶颗粒悬浮液2～8％，proclin-300防腐剂100μl～300μl。上述试剂ⅰ和试剂ⅱ中磷酸盐缓冲液的ph值为8.0±0.2。

上述测定中反应物的体积比为：样品∶试剂i∶试剂ii＝1∶40～60∶5～10。

本方法的试剂虽与原有的lpa试剂组分相同，只是将采用先后双试剂测定方法，试剂ⅰ和试剂ⅱ均为抗人脂蛋白a抗体试剂，可以通过实时反应曲线监测到lpa过剩现象，测定效果明显不同。

本发明与现有技术相比有如下优点：原有的lpa测定方法不能监测到lpa过剩现象，而本发明方法可以监测到lpa过剩现象，是一种准确性更高的lpa检测方法。

附图说明

附图1.是单一试剂法实时反应曲线；

附图2是本发明方法已达到反应终点时实时反应曲线；

附图3是本发明方法抗原过剩时实时反应曲线。

具体实施方式：

下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

试剂的组成：

a.试剂ⅰ：

甘氨酸0.17mmol/l，氯化钠0.10mmol/l，包被抗-lpa抗体的乳胶颗粒悬浮液5％，proclin-300防腐剂200μl。

b.试剂ⅱ：

甘氨酸0.17mmol/l，氯化钠0.10mmol/l，包被抗-lpa抗体的乳胶颗粒悬浮液5％，proclin-300防腐剂200μl。

c.标准液：采用1000mg/l定值血清进行多点定标。

上述测定中反应物的体积比为：样品∶试剂i∶试剂ii＝1∶50∶5。

实施例3

测定程序

研究对象住院及门诊患者45例进行空腹采血2.0ml，离心后分离血清进行lpa测定，应用单一试剂法和本发明方法进行lpa测定，并观察实时反应曲线，下面通过单一试剂法和本发明专利法进行说明本发明的检测效果

1.双试剂法：在日本olympusau2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将5μl样品加入到250μl试剂ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入50μl试剂ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在340nm波长处检测。仪器自动计算出lpa结果，具体见表1：

表1.本发明自动化生化分析仪测试条件

计算公式为：

odlpa＝od2-od1

脂蛋白a浓度＝f×odlpa

其中odlpa是脂蛋白a产生的吸光度，od1是样品加入前测得的吸光度，od2是加入试剂ⅰ反应后测得的吸光度，f是校正因数。

2.单一试剂法：在日本olympusau2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将5μl样品加入到225μl试剂中混匀，37℃孵育3分钟，全自动分析仪在340nm波长处检测，仪器自动计算出lpa结果。

研究表明在lpa0.8～926.5mg/l时，两种方法测定结果无显著性差异，n＝45，t＝3.23,p＝0.3338，实时反应曲线如图1,2所示，测定结果均可靠，本发明方法加入试剂ii后可出现平坦的曲线如图2；在lpa大于926.5mg/l时，单一试剂法测定结果显示926.5mg/l，本发明方法除计算出测定结果外，加入试剂ii后实时反应曲线可出现双峰现象，可提示lpa出现过剩，反应未达到终点，应稀释后重测方可报出准确结果，如图3所示。本发明方法在lpa过量与适量呈现出不同的实时反应曲线，如图2,3比较。

经过以上比较可看出，本发明虽与原配方组成相同，但因采用先后双试剂法，可以监测到抗原在反应液中过剩的现象，达到了准确检测的目的。