定量检测人类补体因子H相关蛋白的检测试剂卡及系统的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域。

背景技术：

人补体因子h相关蛋白(humancomplementfactorhrelatedprotein)，又称为膀胱肿瘤抗原(bladdertumorantigen)，补体因子h（complementfactorh）是其具体成分，补体因子h是由癌症细胞和巨噬细胞产生的，不是正常表皮细胞产生的，肿瘤细胞分泌内源性基底蛋白与基底膜表面蛋白受体结合，并释放蛋白水解酶破坏基底膜，基底膜碎片（胶原片段、糖蛋白和蛋白多糖等）进入膀胱内聚成高分子复合物。大小为16～165kd，随尿液排出，可作为膀胱肿瘤抗原检测出来。

目前临床上诊断检测表浅膀胱肿瘤标准方法主要有尿脱落细胞学检查、膀胱镜检及组织活检。尿脱落细胞学检查特异性高，但对分级低的膀胱肿瘤敏感性低，尤其易漏检c1级肿瘤。而膀胱镜是有创检查，且费用高，不能早期诊断且患者依从性差。尿脱落细胞学检查，留置24小时尿，取下面沉积的尿液做显微镜检查，连续做三天。膀胱肿瘤活检一般是膀胱镜下用钳取一块组织做病理学检查。封蜡切片镜检尿脱落细胞学检查主要用于上尿路细胞癌，尿路上皮癌最重要的临床特点是容易复发并且随着复发次数增加肿瘤更倾向恶性。因此选择合适的分子生物学标志预测尿路上皮癌的复发，可早期采取有效治疗措施，减少肿瘤进展机会。

膀胱肿瘤的筛查首先采用超声，超声发现有东西，做盆腔ct，如果要确定是不是肿瘤，做膀胱镜取组织活检（是不做尿脱落细胞学的）先超声（无创又便宜），然后再ct（昂贵又有射线），最后才是膀胱镜（有创还昂贵）。

现阶段，急迫需要研发出一种能够作为膀胱肿瘤早期诊断又快速定量的一种检测系统，且方法可普遍用于大众。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种定量检测人类补体因子h相关蛋白的检测试剂卡及系统，本发明系统读数准确、数据可靠；检测效率高，整个检测过程仅需15min即可完成；灵敏度高，仅需100μl尿样，同时扩大了检测范围，检测范围最高可达32u/ml加强了对膀胱肿瘤不同严重程度风险的参考评估；方法操作简单，尿液样品获取简单方便，且无创无痛苦，可实现患者的床旁检测。

定量检测人类补体因子h相关蛋白的检测试剂卡，从左至右依次设有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

在样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的下方设有背衬。

优选的试剂卡的外侧还设有卡壳。卡壳和背衬用于固定样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。

样品垫是经含0.2%吐温-20的0.1mpbs缓冲液处理的聚酯纤维垫；

胶体金垫上固定有胶体金标记的抗人类补体因子h的抗体；所述胶体金颗粒的粒径为30nm；所述胶体金标记的抗人类补体因子h抗体的量为30μg/ml；

硝酸纤维素膜上有抗人类补体因子h的抗体包被的检测线和igg抗体包被的质控线；所述检测线划线浓度为0.5mg/ml。

抗人类补体因子h的抗体为鼠抗人补体因子h抗体。

igg抗体为兔抗鼠igg抗体。

抗人类补体因子h的抗体为单克隆抗体，igg抗体为多克隆抗体。

胶体金颗粒由1%质量浓度的氯金酸溶液和1%质量浓度的柠檬酸三钠溶液制备，氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为1:2.8。

每ml胶体金溶液中加入30μg的抗人类补体因子h抗体，用0.1mol/l的k2co3调节ph。

定量检测人类补体因子h相关蛋白的系统包括检测试剂卡和免疫定量分析仪；试剂卡从左至右依次设有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

在样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的下方设有背衬。试剂卡的外侧还可以设有卡壳。卡壳和背衬用于固定样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。

免疫定量分析仪内部还包括储存有所述检测试剂卡标准曲线的测试芯片；标准曲线的获取方法为：使用免疫定量分析仪检测不同浓度的人类补体因子h蛋白标准液，绘制标准曲线，储存于测试芯片中。

本发明系统的工作原理为：将检测样品滴加到样品垫上，样品与胶体金垫上的胶体金及抗体的结合物充分反应，形成样品-胶体金-抗体复合物；由于硝酸纤维素膜的毛细管作用，其样品-胶体金-抗体复合物将沿着该膜向前移动，当移动至检测线t、质控线c固定有抗体的区域上时，样品-胶体金-抗体复合物与其区域的抗体发生特异性结合，从而实现特异性的免疫诊断。

本发明系统的使用方法为：

步骤一：将检测样品加于检测试剂卡样品垫的加样区域；

步骤二：使用免疫定量分析仪读取所述检测试剂卡检测区的光密度，当补体因子h蛋白＞0.5u/ml，表示患有膀胱肿瘤的风险较大；当补体因子h蛋白＜0.5u/ml，表示患有膀胱肿瘤的风险较小。

本发明的检测方法所述样品为人体尿液，所述样品的加样量为100～300μl。

免疫定量分析仪用于检测试剂卡检测区的光密度。

样品垫的作用是用于吸收样品。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明系统包括检测试剂卡和免疫定量分析仪，免疫定量分析仪检测所述试剂卡检测区的光密度，可实现对人类补体因子h蛋白的定量检测，进而实现对膀胱肿瘤风险的参考评估，当补体因子h蛋白＞0.5u/ml，表示患有膀胱肿瘤的风险较大；当补体因子h蛋白＜0.5u/ml，表示患有膀胱肿瘤的风险较小。

免疫定量分析仪还包括储存有所述试剂卡的标准曲线的测试芯片。通过免疫定量分析仪读取芯片中的标准曲线，可节省临床获取的标准曲线的时间，使得整个检测过程仅需15min即可完成，提高了检测效率。

试剂卡含有两株抗人类补体因子h的单克隆抗体。第一个鼠抗人补体因子h蛋白的单克隆抗体与胶体金偶联结合于金垫上，其可与尿液结合。第二个鼠抗人补体因子h蛋白的单克隆抗体置于硝酸纤维素膜上，与第一个单克隆抗体的免疫结合物反应，从而实现检测尿液中特定补体因子h蛋白的目的，其提高了灵敏度，仅需100μl尿样，同时扩大了检测范围，检测范围最高可达32u/ml加强了对膀胱肿瘤不同严重程度风险的参考评估。

本发明的检测试剂卡的胶体金颗粒的粒径为30nm，标记抗体的效价为1：2-4×10⁶，检测线鼠抗人补体因子h蛋白的抗体划线浓度为0.5mg/ml，在此工艺下可保证本发明的免疫定量分析仪可实现准确的读数，其数据可靠。

本发明的系统操作简单，检测样品为尿液，样品获取简单方便，且无创无痛苦，可实现患者的床旁检测。

附图说明

图1为本发明检测试剂卡的结构示意图；

图2为胶体金形态示意图；

图3为胶体金紫外扫描鉴定示意图；

图4为胶体金结合抗体原理示意图；

图5为检测芯片的标准曲线；

其中，1为样品垫，2为胶体金垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸水垫，5为背衬，6为检测线t，7为质控线c。

具体实施方式

实施例1

一种定量检测人类补体因子h相关蛋白的系统，包括检测试剂卡和免疫定量分析仪；

试剂卡从左至右依次设有样品垫1、胶体金垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4；

在样品垫1、胶体金垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4的下方设有背衬5；

免疫定量分析仪内部还包括储存有所述检测试剂卡标准曲线的测试芯片。

本发明检测试剂卡的制备过程为：

一、抗人类补体因子h抗体的制备及配对抗体的确定

鼠抗人类补体因子h蛋白单克隆抗体的制备与纯化：人类补体因子h蛋白作为免疫抗原免疫6周龄健康balb/c雌性小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗人类补体因子h蛋白特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法进行抗体纯化。

单克隆抗体的筛选：筛选得到80株单克隆细胞株抗体，经elisa相加试验检测得出单克隆抗体1h8与6c9为配对抗体，且相加指数最高，其相加指数ai=97.6%，两株抗体所结合抗原的不同构象表位且距离很远，并将其两株抗体分别包被硝酸纤维素膜及标记胶体金，进行测定人类补体因子h蛋白，结果显示1h8标记胶体金与6c9包被硝酸纤维素膜检测显示效果较好，其中1h8单抗效价为1:2.8×106，6c9单抗效价为1：4×106，亚型均为igg1，蛋白浓度分别为5mg/ml、6.2mg/ml，适合于下一步胶体金检测试剂卡装置的制备。

二、胶体金的制备

胶体金（colloidalgold）是氯金酸（haucl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。胶体金的质量判定标准质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，无棱角且粒径分布均匀。（如图2，图3所示）质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。

在氯化金（haucl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子（免疫球蛋白）的正电荷基团形成牢固的结合形成胶体金标记物，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。（如图4）

本发明使用柠檬酸三钠法制备30nm胶体金，取250ml三角瓶一个，加100ml双蒸水及1ml1%氯化金，加热沸腾；取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。本发明加入2.8ml的柠檬酸三钠，得到30nm的胶体金颗粒用于下一步实验。shape\*mergeformat

胶体金适宜标记浓度、ph的确定

抗体与胶体金结合最佳ph测定：由于蛋白最佳ph范围较窄，设置的梯度不能太大。取一96孔培养板，按ph从低到高分别将上述胶体金分别取100μl加入孔中，以0.1mol/lk2co3调节ph值为7.2，7.6，7.9，8.2(复孔)，8.5（复孔），8.8，9.2以及空白孔，用0.22μm微孔滤膜过滤或高速离心去除抗体中残物或多聚体,将其各孔定量加入，混合室温放置15min，分别加入10%nacl溶液，混合室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低ph为8.2，其未出现颜色变化和聚沉现象，8.2为最适宜ph。

抗体与胶体金结合最佳浓度测定：将胶体金用0.1mol/lk2co3ph调至8.2，取一96孔培养板，每100μl加入各孔，用0.22μm微孔滤膜过滤或高速离心去除抗体中残物或多聚体，加入各孔抗体量为0.5μg，1.0μg，1.5μg，2.0μg，2.5μg（复孔），3.0μg（复孔），3.5μg（复孔），混合室温下放置5min，加入10％nacl后观察，颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度，在实际探针制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的120％。本发明第五、六孔为最小蛋白浓度即2.5μg抗体标记100μl胶体金，实际在此基础上再加20%即3μg，即稳定1ml胶体金最佳标记蛋白量为30μg。

胶体金标记抗人类补体因子h单克隆抗体（图3）：将ph8.2的30nm胶体金溶液取出1ml，加入30μg的1h8纯化抗体混匀，室温放置10min，加入10μl的2%peg20000，室温放置5min；10000rpm离心20min，轻轻吸除上清；0.1mpbst溶液重悬浮松散的胶体金沉淀，并集中到新管中，充分混匀，-20℃保存备用。

三、硝酸纤维素膜上检测线浓度的确定

本实施例中质控线（c线）用兔抗鼠igg抗体包被，检测线（t线）为6c9抗体包被。固定c线浓度，改变t线浓度，以t线深浅、灵敏度等为参考，选出t线划线的最佳浓度。t线划线浓度分别为0.4mg/ml，0.5mg/ml，0.6mg/ml，由检测试验得出当t线划线浓度为0.5mg/ml时，显色很深，仪器易判读，不会浪费抗体，因此t线最佳划线浓度为0.5mg/ml。

四、测试芯片制备

将人类补体因子h蛋白配制成0.5u/ml，1u/ml，2u/ml，4u/ml，8u/ml，16u/ml，32u/ml等系列标准溶液。用本发明的检测试剂卡，每个浓度重复3次，进行免疫定量分析仪读数，从而获得人类补体因子h蛋白光密度与浓度的标准曲线。最终确定标准曲线（如图5所示）。本发明制备的检测试剂卡的检测灵敏度达0.5u/ml，在0.5-32u/ml的范围内线性为r²=0.9987。

由于每批的检测试剂卡存在制做与操作的差异，需在同一浓度批内的重复性，将人类补体因子h蛋白配制成1u/ml标准溶液，做15个重复，进行检测，并观察其重复性，如表1所示，批内的cv=10.3%

表1不同检测试剂卡的重复性测试数据

五、使用本发明系统进行实际样本的检测

河北某医院病例监测，2016.11-2017.5共80例疑似患者因血尿（53例）或其他主诉到某医院门诊就诊。

本组80例，男61例，女19例，年龄20-88岁。

所有患者入院后进行常规术前检查，及b超、ct或ctu等影像学检查。

所有患者的尿液样本在膀胱镜检查前留取，进行本发明检测试剂卡的检测。

阳性64例：包括尿路上皮肿瘤51例（膀胱癌34例，肾盂肿瘤10例，输尿管肿瘤7例)；膀胱上皮乳头状增生伴异增4例，输尿管结石5例，泌尿系感染2例，乳糜尿1例，膀胱全切术后肾积水1例；本发明检测试剂卡＞0.5u/ml。

阴性16例：包括膀胱癌1例，肾透明细胞癌1例，前列腺癌例，肾囊肿3例，尿道肉阜1例，前列腺增生4例，输尿管结石1例，膀胱癌术后复查未见异常5例；本发明检测试剂卡检测＜0.5u/ml。