基于铜锌锡硫合金量子点的多巴胺检测方法与流程

文档序号：16642654发布日期：2019-01-16 07:46阅读：419来源：国知局

本发明属于生物检测技术领域，更加具体地说涉及，一种在水热条件下制备铜锌锡硫(czts)合金量子点的方法以及基于铜锌锡硫合金量子点的多巴胺检测方法。

背景技术：

从上世纪70年代开始，人们就将关注点落在了半导体纳米晶上，至今已应用于众多领域。量子点由于其纳米级的尺寸效应具有了许多特殊性质，例如独特的光学和电学性质。正是由于这些独特的光、电学性质，使得量子点成为一种方兴未艾的研究工具。起初人们希望可以利用量子点的特殊性质制成量子计算机，但一直没有很大突破。之后人们又将量子点应用于生物领域，但由于当时量子点制备困难，合成条件苛刻，且量子点荧光产率低，不易与生物分子结合，所以未见明显成效。随研究者们的不断尝试，量子点的合成方法不断优化，通过水相合成的量子点不仅可以应用于各种生物成像标记研究，在生命科学研究方面的前途更是不可限量。合金量子点可以通过调节各组分含量来改变其内部结构，达到改变其荧光发射波长的目的，即发射出不同颜色的荧光。根据以往的报道，合金量子点的荧光强度和效率与普通量子点相仿，甚至可以超过普通量子点。

多巴胺属于生物源儿茶酚胺中的一种，是中枢神经系统中主要的内源性神经递质。大脑中多巴胺的水平与动物的运动能力紧密相关，还参与眼内压和视网膜信息传递的调控。大脑中多巴胺的过量常常引起心情上的愉快和兴奋，而大脑中多巴胺的缺乏可能导致帕金森病和精神分裂症。迄今为止，已有许多可对多巴胺进行定量检测的方法，例如电化学，化学发光，高效液相色谱，毛细管电泳等。然而，上述方法均存在些许弊端，有的所需设备较为昂贵，有的操作过程复杂，有的涉及高毒药品的使用。因此，目前急迫地需要开发一种快速，简便，低成本，灵敏度高和选择性强的方法来检测生物液中痕量多巴胺。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供基于铜锌锡硫合金量子点的多巴胺检测方法，该方法低毒，水溶性好，量子效率高，生物相容性好，成本低廉，步骤简单，对操作人员和仪器设备要求低。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

基于铜锌锡硫合金量子点的多巴胺检测方法，以h3po4-hac-h3bo3缓冲水溶液、铜锌锡硫合金量子点溶液和待测样品溶液组成多巴胺检测体系，使用荧光光度计检测其荧光强度，检测体系的荧光强度随检测体系中多巴胺浓度的增大而下降，即荧光强度呈现出线性猝灭关系；对比标准曲线，即得到检测体系中多巴胺的浓度，利用铜锌锡硫合金量子点定量检测多巴胺在在0.2-300微摩/升的范围内荧光呈线性淬灭，拟合方程式为y＝782.572-3.821x+0.007x²,r²＝0.985；y为检测体系的荧光强度，x为检测体系中多巴胺浓度，最低检出限为92nmol/l。

在上述检测方法中，在得到检测体系中多巴胺浓度之后，根据检测体系的组成即可换算出待测样品溶液中多巴胺的浓度。

在上述检测方法中，向离心管中依次加入50-400μl铜锌锡硫合金量子点溶液，铜锌锡硫合金量子点的浓度为1—5mmol/l；100-1000μl0.04mol/lph为12的h3po4-hac-h3bo3缓冲溶液混合均匀后，向其中加入40μl待测样品溶液，再加高纯水定容至4ml，充分混合，静置50—60分钟后用荧光分光光度计进行检测。

在上述检测方法中，优选铜锌锡硫合金量子点溶液为200μl，铜锌锡硫合金量子点的浓度为1mmol/l，h3po4-hac-h3bo3缓冲溶液为200μl，40μl待测样品溶液，再加高纯水定容至4ml。

在上述检测方法中，使用的激发波长为300-500纳米；优选地，激发波长为345—355纳米；荧光发射峰的波长为400-600纳米；优选地，荧光发射峰的波长为460—465纳米。

所述铜锌锡硫合金量子点采用水热制备方法按照下述步骤进行制备：

步骤1，按照铜锌锡摩尔比(物质的量比)2:1:1，将铜盐、锌盐、亚锡盐均匀分散在溶剂中形成分散体系，所述溶剂由水和可溶解性高分子组成，可溶解性高分子作为包覆稳定剂；

在步骤1中，铜离子的浓度范围为0.01-0.1mol/l。

在步骤1中，铜盐为氯化铜、硝酸铜、硫酸铜或醋酸铜中的一种。

在步骤1中，锌盐为氯化锌、硝酸锌、硫酸锌或醋酸锌中的一种。

在步骤1中，亚锡盐为氯化亚锡、硝酸亚锡、硫酸亚锡或醋酸亚锡中的一种。

在步骤1中，可溶解性高分子的用量为0.0008—0.6质量份，水为8—10体积份，每一质量份为1g，每一体积份为1ml。

在步骤1中，可溶解性高分子为含有氨基或羧基的大分子聚合物，例如聚乙烯亚胺，聚乙二醇，聚丙烯酸中的一种，数均分子量为10000以下，例如数均分子量为上百的数量级，如200—800，优选400—600；数均分子量为上千的数量级，如1000—8000，优选1000—2000。

步骤2，向步骤1的分散体系中加入硫脲的水溶液并分散均匀，形成cu²⁺、zn²⁺、sn²⁺、s与可溶解性高分子的分散体系；硫脲与铜离子的摩尔比至少为2:1；

在步骤2中，采用滴加加入硫脲的水溶液，速度为每分钟1—5ml。

在步骤2中，采用机械搅拌方式进行分散均匀，搅拌速度为每分钟100—200转。

在步骤2中，硫脲与铜离子的摩尔比为(2—5)：1。

步骤3，将步骤2形成的分散体系通入惰性气体，以除去溶解氧后转入反应釜中，在160—200摄氏度下反应即可得到水溶性的铜锌锡硫合金量子点溶液。

在步骤3中，惰性气体为氮气、氦气或者氩气，通入时间为15—30min。

在步骤3中，在180—200摄氏度下反应6—48小时。

在制备得到铜锌锡硫合金量子点溶液后，溶液呈现淡黄色溶液，可通过烘干方式得到量子点(宏观观察并非粉末，但呈现类似胶状)，可再均匀分散在水中。在进行检测时，可直接使用步骤3得到的水溶性铜锌锡硫合金量子点(水)溶液，根据投料比例进行计算步骤3得到的溶液中量子点的浓度，再根据检测体系的组成计算出最终检测体系中的量子点浓度。

在本发明技术方案中，水热反应中160—200℃的温度为生成铜锌锡硫化合物提供条件，在投料中铜锌锡硫的摩尔比为2:1:1:4，其中元素硫保持略微过量，在加入体系后同时体现出还原和掺杂作用，以使四种元素保持稳定的摩尔比生成cu2zn1sn1s4，在氮气保护的状态下，除去了溶解氧使得各种金属盐不会被氧化而会生成合金化合物。pei的加入恰当的控制了合金化合物的生长尺寸，一方面，pei作为稳定剂，使得生成的合金化合物纳米粒子之间保留一定得间距，从而实现其具有荧光性能的量子特性，另一方面，pei作为包覆剂，使得量子点表面带有氨基作为活性官能团，能实现与其他物质的良好结合。

使用tem对制备的量子点进行表征，从图中可知合成的新型量子点，尺寸均一，形状近球形，粒径大小为2±0.5nm；使用紫外分光光度计进行表征(仪器型号：uv-2600；生产公司：日本岛津公司)，由图可以说明合成的新型量子点在345—355nm有紫外吸收，这与其荧光激发波长相一致，并在受到激发后于460—465nm处发射荧光。以ftir进行表征，通过对比可以看出，合成的新型量子点表面包覆有聚乙烯亚胺，即氨基为其活性基团，说明可溶性高分子成功包覆稳定量子点，其官能基团(氨基、羟基或者羧基)为活性基团。

与现有技术相比，本发明提供了一种能在水溶液中直接合成出来的亲水性铜锌锡硫(czts)量子点的方法。铜锌锡硫被广泛应用于太阳能电池薄膜材料，但目前鲜有报道将其调控合成作为量子点使用。本发明提供的合成方法成本低廉，步骤简单，对操作人员和仪器设备要求低，得到的铜锌锡硫量子点均一稳定、低毒、水溶性好、量子效率高、生物相容性好、是一种良好的荧光标记物。

本发明用铜、锌和亚锡的水溶性无机盐在水相中制得水溶性的铜锌锡硫(czts)合金量子点。本发明方法成本低廉，步骤简单，对操作人员和仪器设备要求低，为之后大规模合成制备提供了可能。合成得到的铜锌锡硫量子点均一稳定、低毒、水溶性好、量子效率高、生物相容性好、是一种良好的荧光标记物。本发明提供的一种利用免标记、无修饰的合金量子点作为荧光探针检测多巴胺的方法，该方法利用多巴胺对该量子点的特异性猝灭的现象，通过制备特定的荧光探针，实现免标记即可定量检测多巴胺的目的，灵敏度高，准确度高，在各种实际样品的检测中都有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明技术方案制备的水溶性铜锌锡硫合金量子点的透射电镜(tem)照片。

图2为本发明技术方案制备的水溶性铜锌锡硫合金量子点的紫外吸收图。

图3为本发明技术方案制备的水溶性铜锌锡硫合金量子点和聚乙烯亚胺的傅里叶变换红外光谱图(ftir)。

图4为本发明水溶性铜锌锡硫合金量子点在合成过程中优化加热时长的荧光谱图。

图5为本发明水溶性铜锌锡硫合金量子点在合成过程中，随pei加入量的不同，荧光发射波长变化的谱图。

图6为利用铜锌锡硫合金量子点检测多巴胺的荧光淬灭示意图。

图7为利用本发明铜锌锡硫合金量子点定量检测多巴胺的线性图(即标准曲线)，横坐标为检测体系中多巴胺的浓度，纵坐标为检测体系的荧光强度。

图8为在铜锌锡硫合金量子点溶液中加入不同浓度的多巴胺后，合金量子点溶液颜色逐渐加深的裸眼可见图。

图9为在铜锌锡硫合金量子点溶液中加入相同浓度的不同物质后，合金量子点溶液荧光强度的变化结果示意图。

具体实施方式

通过下面结合附图对其示例性实施例进行的描述，本发明上述特征和优点将会变得更加清晰和容易理解。下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明。本发明所述的高纯水购买于天津师范大学水资源与水环境重点实验室(对外有售)，聚乙烯亚胺购买于北京麦克林生物试剂有限公司，其他无机试剂均购买于天津市科威有限公司。采用机械搅拌装置进行分散，搅拌速度为每分钟150转。

实施例1—水溶性铜锌锡硫(czts)量子点的制备分为以下步骤：

a.室温20摄氏度条件下称取0.0008g的聚乙烯亚胺(pei，数均分子量10000)溶于9ml水中作为盐溶液的溶剂；

b.取铜锌锡的物质的量比为2:1:1，将氯化铜、氯化锌、氯化亚锡溶于上述溶液，充分搅拌，使之均匀的分散在溶液里，制备得到同时含有cu²⁺、zn²⁺、sn²⁺的溶液，其中铜离子的浓度范围为0.04mol/l；

c.然后向上述体系中缓慢加入硫脲的水溶液，每分钟5ml，硫脲与铜离子加入的摩尔比为2:1，充分搅拌后形成cu²⁺、zn²⁺、sn²⁺与聚合物pei的配位化合物并良好的分散在溶液中；