一种基于多巴胺的生物激发信号放大系统和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物化学的检测和分析领域，具体的说是一种基于多巴胺的生物激发信号放大系统和应用。将结合有特异性的功能分子的多巴胺，即为生物激发信号放大系统。所述多巴胺的生物激发信号放大系统应用于生物分析领域用于检测生物分子。本发明利用特异性分子标记的多巴胺放大信号系统来快速检测和分析生物分子，比如蛋白因子、核酸、微生物、病毒等，用其检测检测控制生物分子浓度的变化，能够快速检测对生物分子、微生物和细胞。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量，本发明的快速检测和分析生物分子具有显著的特异性，同时准确性高。利用多巴胺放大信号系统来快速检测和分析生物分子，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。
【专利说明】—种基于多巴胺的生物激发信号放大系统和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学的检测和分析领域，具体的说是一种基于多巴胺的生物激发信号放大系统和应用。
【背景技术】
[0002]在环境安全检测和人体健康的监控中，许多生物靶点分子的含量非常低。很多生物信号分子、有害微生物或肿瘤细胞在初期浓度非常低，需要对靶点物质进行信号放大才可以检测分析。目前，研究者们已经发现了几种信号放大的技术来检测低丰度靶点，包括银增加强反应、酪氨酸信号放大、酶金属矿化和滚环放大报告系统。银增强反应基于纳米金催化沉淀银，从而来检测核酸、蛋白质和微生物等有害物质(Wan，Y., Wang, Y., ffu, J., Zhang, D.,2011b.Analytical Chemistry83(3), 648-653 ；Taton,T.A., Mirkin, C.A., Letsinger, R.L.，2000.Science289 (5485)，1757-1760.)。相对银增强的技术来说，替代的方案用过氧化物酶来催化银的沉淀，这种方法叫酶矿化技术(Mm ler, R.，Powell, R.D.，Hainfeld, J.F.，Fritzsche, W.，2005.Nano Letters5 (7)，1475-1482)。最近出现一种超灵敏的技术，结合氢化酶标记的酶联免疫反应来控制纳米金生成过程，产生肉眼可见的信号(de IaRica, R., Stevens, Μ.Μ., 2012.Nature Nanotechnology do1: 10.1038/nnan0.2012.186),来分析生物靶点物质。酪氨酸信号放大系统结合生物沉淀和荧光标记来增强标准免疫反应的灵敏度(Clutter, M.R., Heffner, G.C., Krutzik, P.0., Sachen, K.L., Nolan, G.P., 2010.Cytometry Part A77A(11)，1020-1031)。滚环放大技术是一种恒温核酸扩增方法,在RCA反应中，DNA目标链可沿环形探针顶替扩增，实现高灵敏度的检测；同时环形探针的链接成环对DNA单碱基错配有很高的特异性，适合单核苷酸突变的分析检测。
[0003]多巴胺是一种包含有苯酚结构和氨基官能团用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。它广泛存在于动物体内，特别是在贝壳类粘附蛋白中已经发现高浓度的多巴胺。多巴胺是一种很神奇的分子，这种脑内分泌物质主要负责大脑的情欲，感觉，传递兴奋及开心等信息，也与上癒有关。
[0004]当pH为8.5时，多巴胺能够发生聚合形成聚多巴胺。聚合膜与贝壳类粘附蛋白的结构很相似。聚多巴胺膜这种特殊的结构，能够用于化学反应吸附和沉积生物或者化学分子。它能够与很多种类的无机材料形成强的化学键结构，这种键的作用力比生物素-亲和素作用交联还要强(Ryu, J., Ku, S.H., Lee, H., Park, C.B., 2010.Advanced Funct1nalMaterials20 (13) ,2132-2139)。因此，多巴胺的自聚合被用作一种多功能的强力复合膜覆盖在金属材料、陶瓷、金属氧化物以及聚合物表面。聚多巴胺不仅能够作为固定的检测平台，而且可以作为交联试剂来固定生物化学分子。首先，生物传感器的固定平台对传感器的选择性、检测限以及稳定性有重要影响。许多不同的检测平台，如自组装膜、有机聚合材料、纳米材料掺杂的聚合膜，已经用于抗体以及其他蛋白的固定。这些材料具有良好的生物相容性和有序的结构，使其能够在微生物检测以及细胞行为研究方面发挥重要的作用。其次，对于研究危害人体健康的微生物检测以及环境体系中生物安全和污染而言，抗体及其它蛋白的固定扮演很重要的角色。抗体及其他生物分子在表面的固定分为非共价交联和共价交联反应。非共价交联是通过物理吸附、蛋白相互作用、氢键、范德华力作用以及疏水相互作用使生物或者化学分子能够在长时间内(>12h)固定在固体物质表面。共价交联是在自组装膜的表面通过EDC/NHS在短时间内激活，使生物或化学分子修饰到自组装膜的表面形成稳定的、可重复的、可靠的生物功能膜(Kang, S.M., You, 1., Cho, ff.Κ., Shon, Η.K., Lee, Τ.G., Choi, 1.S., Karp, J.Μ., Lee, H., 2010.Angewandte Chemie-1nternat1nalEdit1n49 (49) ,9401-9404)。最近的研究表明，蛋白分子可以通过聚多巴胺的结构直接修饰到固定的表面形成功能膜。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种基于多巴胺的生物激发信号放大系统和应用。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]—种基于多巴胺的生物激发信号放大系统，将结合有特异性的功能分子的多巴胺，即为生物激发信号放大系统。
[0008]所述特异性的功能分子可为生物素、主客体分子、重氮盐、适配体、抗体或组氨酸标签。
[0009]基于多巴胺的生物激发信号放大系统的应用，所述多巴胺的生物激发信号放大系统应用于生物分析领域用于检测生物分子。
[0010]所述多巴胺的生物激发信号放大系统应用于免疫吸附测定、电化学生物传感器、荧光显微镜技术或激光扫描共聚焦显微镜技术中进行生物分子的检测。
[0011]所述多巴胺的生物激发信号放大系统在过氧化物酶的催化作用下，功能化的多巴胺分子聚合沉淀到生物靶点分子表面，聚合的特异性的功能分子同时提供大量的活性功能位点。
[0012]所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶或氢化酶。
[0013]本发明所具有的优点:
[0014]本发明利用特异性分子标记的多巴胺放大信号系统来快速检测和分析生物分子，比如蛋白因子、核酸、微生物、病毒等，用其检测检测控制生物分子浓度的变化，能够快速检测对生物分子、微生物和细胞。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量，利用多巴胺放大信号系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性，同时准确性高。利用多巴胺放大信号系统来快速检测和分析生物分子，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例提供生物激发的多巴胺信号放大系统示意图(a)和多巴胺介导的酶联免疫反应吸附测定(b)，传统的酶联免疫反应吸附测定作为控制对照试验。
[0016]图2为本发明实施例提供的生物激发的多巴胺信号放大系统介导的酶联免疫吸附测定和传统的酶联免疫吸附测定分析肿瘤坏死因子-α的标准对照曲线。
[0017]图3为本发明实施例提供生物激发的多巴胺信号放大系统介导的酶联免疫吸附测定和传统的酶联免疫吸附测定分析肿瘤坏死因子-α和其他非特异性蛋白因子的信号强度，所有蛋白因子的浓度为1.0X10_8mol L'
【具体实施方式】
[0018]下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0019]实施例1:
[0020]传统的酶联免疫吸附测定和多巴胺介导的免疫反应检测人体肿瘤坏死因子- α。
[0021]100 μ L鼠抗肿瘤坏死因子-α抗体滴加在96孔板表面4°C过夜，用缓冲液清洗三次；加入200 μ L封闭液，室温下反应30min，再用缓冲液清洗三次；再加入重组的人体肿瘤坏死因子-α (ΙΟ44到l(T5mol Γ1)，37°C反应lh。接着加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的兔抗人体肿瘤坏死因子-α抗体，37°C反应lh。
[0022]对于传统的酶联免疫吸附测定来说，每孔加入100 μ L TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ Llmol L-1H2SO4,终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据(参见图3)，其检测范围为1.0X10-n-1.0X10-6mOl L-1。检测限为1.9X 10-nmol L—1，分析灵敏度7.9Xl(Tnmol L'
[0023]对于多巴胺介导的酶联免疫吸附测定来说，100 μ L生物素标记多巴胺工作液加入每孔，室温下反应20min，用缓冲液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记亲和素，37°C反应lh，用缓冲液清洗三次。每孔加入10yL TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ Llmoir1H2SO4，终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据。(参见图3)具其检测范围为 1.0X10_13-1.0X10_6mol L' 检测限为 4.1 X 1(Γ13，分析灵敏度 1.2 X l(T12molL'
[0024]其中，生物素标记多巴胺步骤为:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽键缩合剂(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二异丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反应 24h。再加入乙醚(30mL),过滤白色固体，用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg终产物。
[0025]实施例2:
[0026]传统的酶联免疫吸附测定和多巴胺介导的免疫反应检测硫酸盐还原菌。100 μ L硫酸盐还原菌抗体滴加在96孔板表面4°C过夜，用缓冲液清洗三次；加入200 μ L封闭液，室温下反应30min，再用缓冲液清洗三次；再加入硫酸盐还原菌(11到108cfu mL—1)，37°C反应lh。接着加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的硫酸盐还原菌抗体，37°C反应lh。
[0027]对于传统的酶联免疫吸附测定来说，每孔加入100 μ L TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ Llmol L-1H2SO4，终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据。，其检测范围为 1.0XlO2-L OXlO6Cfu mL' 检测限为 200cfu mL—1，分析灵敏度 10cfu mL'
[0028]对于多巴胺介导的酶联免疫吸附测定来说，100 μ L生物素标记多巴胺工作液加入每孔，室温下反应20min，用缓冲液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记亲和素，37°C反应lh，用缓冲液清洗三次。每孔加入10yL TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ LlmolL-1H2SO4，终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据。用酶标板分析仪分析相关数据。，其检测范围为1.0X 11-L OX 17Cfu mL'检测限为δΟπιοΙΓ1，分析灵敏度 1cfu HiTr1O
[0029]其中，生物素标记多巴胺步骤为:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽键缩合剂(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二异丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反应 24h。再加入乙醚(30mL),过滤白色固体，用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg终产物。
[0030]实施例3:
[0031]传统的酶联免疫吸附测定和多巴胺介导的免疫反应检测黄曲霉素。100 μ L黄曲霉素抗体滴加在96孔板表面4°C过夜，用缓冲液清洗三次；加入200 μ L封闭液，室温下反应30min，再用缓冲液清洗三次；再加入黄曲霉素(10_14到10_5mol L—1)，37°C反应lh。接着加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的黄曲霉素抗体，37°C反应lh。
[0032]对于传统的酶联免疫吸附测定来说，每孔加入100 μ L TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ Llmol T1H2SO4，终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据。其检测范围为 2.1Χ10_1(ι-2.lX10_6mOl L' 检测限为 5.0 X l(Tnmol ?Λ 分析灵敏度 7.9 X l(Tnmol
I/1。
[0033]对于多巴胺介导的酶联免疫吸附测定来说，100 μ L生物素标记多巴胺工作液加入每孔，室温下反应20min，用缓冲液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记亲和素，37°C反应lh，用缓冲液清洗三次。每孔加入10yL TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ Llmoir1H2SO4，终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据，其检测范围为2.1Χ1(Γ12-2.lXl(T6mol I71，检测限为 2.I X l(T12mol Γ1，分析灵敏度 1.0 X l(T12mol L'
[0034]其中，生物素标记多巴胺步骤为:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽键缩合剂(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二异丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反应 24h。再加入乙醚(30mL),过滤白色固体，用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg终产物。
[0035]实施例4:
[0036]传统的电化学免疫吸附测定和多巴胺介导的电化学免疫反应检测人体肿瘤坏死因子-α。100 μ L鼠抗肿瘤坏死因子-Ct抗体修饰在金电极表面4°C过夜,用缓冲液清洗三次；加入200 μ L封闭液，室温下反应30min，再用缓冲液清洗三次；再加入重组的人体肿瘤坏死因子-α (ΙΟ44到l(T5mol Γ1)，37°C反应lh。接着加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的兔抗人体肿瘤坏死因子-α抗体，37°C反应lh。
[0037]对于传统的电化学免疫吸附测定来说，每孔加入100 μ L TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50yLlmol T1H2SO4，终止反应进行。用电化学分析仪分析相关数据。其检测范围为2.0X 10_n-2.0X 1-6H1l L-1。检测限为0.9X 10-nmol L—1，分析灵敏度7.9Xl(T13mol L'
[0038]对于多巴胺介导的电化学免疫吸附测定来说，100 μ L生物素标记多巴胺工作液加入每孔，室温下反应20min，用缓冲液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记亲和素，37°C反应lh，用缓冲液清洗三次。每孔加入10yL TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ Llmol T1H2SO4，终止反应进行。用电化学分析仪分析相关数据。其检测范围为 L OXKT12-L OX l(T5mol L' 检测限为 1.9X10_13mol ?Λ 分析灵敏度 8.9X 10_14molL'
[0039]其中，生物素标记多巴胺步骤为:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽键缩合剂(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二异丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反应 24h。再加入乙醚(30mL),过滤白色固体，用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg终产物。
[0040]实施例5:
[0041]传统的电化学免疫吸附测定和多巴胺介导的电化学免疫反应检测硫酸盐还原菌。100 μ L硫酸盐还原菌抗体滴加在金电极表面4°C过夜，用缓冲液清洗三次；加入200 μ L封闭液，室温下反应30min，再用缓冲液清洗三次；再加入硫酸盐还原菌(11到18CfumL—1)，37V反应lh。接着加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的硫酸盐还原菌抗体，37V反应Ih0
[0042]对于传统的电化学免疫吸附测定来说，每孔加入100μ L TMB显色液，室温下20min,再在每孔加入50 μ Llmol L4H2SO4,终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据。用酶标板分析仪分析相关数据。，其检测范围为2.0X 102-2.0X 16Cfu mL—1。检测限为300cfuml/1,分析灵敏度10cfumL'
[0043]对于多巴胺介导的电化学免疫吸附测定来说，100 μ L生物素标记多巴胺工作液加入每孔，室温下反应20min，用缓冲液清洗三次。再每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记亲和素，37°C反应lh，用缓冲液清洗三次。每孔加入10yL TMB显色液，室温下20min，再在每孔加入50 μ Llmol T1H2SO4，终止反应进行。用酶标板分析仪分析相关数据。用酶标板分析仪分析相关数据。，其检测范围为2.0X lO1-〗.0X 17Cfu mL—1。检测限为20cfu mL—1，分析灵敏度1cfu mL'
[0044]其中，生物素标记多巴胺步骤为:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽键缩合剂(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二异丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反应 24h。再加入乙醚(30mL),过滤白色固体，用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg终产物。
[0045]实施例6:
[0046]传统的免疫荧光测定和多巴胺介导的免疫荧光检测人体肿瘤坏死因子-α。100 μ L鼠抗肿瘤坏死因子-α抗体滴加在玻璃片表面4°C过夜，用缓冲液清洗三次；加入200 μ L封闭液，室温下反应30min，再用缓冲液清洗三次；再加入重组的人体肿瘤坏死因子-α (10_14到10_5mol Γ1)，37V反应lh。接着加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的兔抗人体肿瘤坏死因子-α抗体，37°C反应lh。
[0047]对于传统的免疫荧光测定来说，每孔加入100 μ L荧光显色液，室温下20min，终止反应进行。用激光扫描共聚焦显微镜分析相关数据。其检测范围为2.0X 10_n-2.0X 10_6molL' 检测限为 0.9X10_nmol ?Λ 分析灵敏度 7.9 X 10_13mol L'
[0048]对于多巴胺介导的免疫荧光检测定来说，100 μ L生物素标记多巴胺工作液加入每孔，室温下反应20min，用缓冲液清洗三次。再每孔加入100 μ L荧光素标记亲和素，37°C反应lh，用缓冲液清洗三次。用激光扫描共聚焦显微镜分析相关数据。其检测范围为
1.0X10_12-1.0X10_5mol L—1。检测限为 1.9X10_13mol L—1，分析灵敏度 8.9 X 10_14mol L—1。
[0049]其中，生物素标记多巴胺步骤为:生物素(200mg，0.82mmol)和多巴胺(183mg，0.98mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)溶液(3mL)中，然后加入肽键缩合剂(HBTU)(342mg, 0.98mmol)和二异丙基乙胺(400 μ L, 2.45mmol),反应 24h。再加入乙醚(30mL),过滤白色固体，用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯:庚烷=1:5)得到120mg终产物。
【权利要求】
1.一种基于多巴胺的生物激发信号放大系统，其特征在于:将结合有特异性的功能分子的多巴胺，即为生物激发信号放大系统。
2.按权利要求1所述的基于多巴胺的生物激发信号放大系统，其特征在于:所述特异性的功能分子可为生物素、主客体分子、重氮盐、适配体、抗体或组氨酸标签。
3.—种权利要求1所述的基于多巴胺的生物激发信号放大系统的应用，其特征在于:所述多巴胺的生物激发信号放大系统应用于生物分析领域用于检测生物分子。
4.按权利要求3所述的基于多巴胺的生物激发信号放大系统的应用，其特征在于:所述多巴胺的生物激发信号放大系统应用于免疫吸附测定、电化学生物传感器、荧光显微镜技术或激光扫描共聚焦显微镜技术中进行生物分子的检测。
5.按权利要求3或4所述的基于多巴胺的生物激发信号放大系统的应用，其特征在于:所述多巴胺的生物激发信号放大系统在过氧化物酶的催化作用下，功能化的多巴胺分子聚合沉淀到生物靶点分子表面，聚合的特异性的功能分子同时提供大量的活性功能位点。
6.按权利要求5所述的基于多巴胺的生物激发信号放大系统的应用，其特征在于:所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶或氢化酶。
【文档编号】G01N33/535GK104165996SQ201310186357
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】万逸, 张盾 申请人:中国科学院海洋研究所