一种来那度胺对映异构体超临界流体色谱分离方法与流程

本发明属于手性色谱分离技术领域，更具体地，涉及一种来那度胺对映异构体超临界流体色谱分离方法。

背景技术：

超临界流体色谱(sfc)是采用超临界流体为流动相，以固体吸附剂或键合到载体上的高聚物为固定相的一种分离技术[journalofchromatographya，2016，1467:33-55]。与hplc相比，sfc分析分离具有速度较快、分析时间短，分离效率高等的显著优势；同时，样品在超临界流体中的溶解度显著增大，有机溶剂消耗大幅降低，超临界流体色谱制备技术被视为一种绿色制备工艺，在拆分手性药物领域引起研究者的极大关注[journalofseparationscience，2014，37:1411-1418；analyticalchemistry，2006，78:3835-3838]。

来那度胺(lenalidomide，商品名revlimid，见式1)，化学名：3-(4-氨基-1,3-二氢-1-氧代-2h-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮，由美国celgene公司研制生产，2005年12月在美国获fda批准上市。研究表明，来那度胺具有比沙利度胺更强的抑制血管生成和免疫调节作用，药效高于100倍，同时神经毒性和不良反应大幅减小，特别是不会引起婴儿出生缺陷，是抗血管增生和抗肿瘤性质的新型免疫调节剂，近年来成为医药领域的超级重磅炸弹式药物。

式（i）

目前，市场销售的来那度胺药品为外消旋混合物[中国新药杂志，2011，20:75-78]。研究者主要采用高效液相色谱法（hplc）对来那度胺原料药和制剂进行纯度分析、杂质检测以及开展药动力学研究[journalofliquidchromatographicrelatedtechnology，2010，33：654-679；现代生物医学进展，2014，14(20):3810-3814；therapeuticdrugmonitoring，2008，30(5)：620-627；中国发明专利申请201410225648.x；中国发明专利申请201210225648.x；国际发明专利wo2011/064574]；另报道采用核磁共振波谱法以马来酸为内标测定来那度胺含量的方法[中南药学，2017，15(2)，214-217]。

然而，对来那度胺进行手性分析分离的研究相对较少。chennh等在astecchirobioticv色谱柱上采用hplc串联质谱法以¹³c5-cc-5013戊二酰亚胺为内标分别对人的血浆、尿液和精液等样品中s-来那度胺和r-来那度胺进行定量测定[thejournalofclinicalpharmacology，2007，47(12):1466-1475；thejournalofclinicalpharmacology，2010，50(7):767-774]；n.z.alzoman在填充涂覆(3-氯-4-甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相的手性柱上，以甲醇-醋酸-三乙胺为流动相、奥硝唑为内标的条件下对来那度胺进行手性定量分析，研究了来那度胺对映异构体在光照、加热、酸、碱和氧化剂等条件下稳定性[journalofchromatographicscience，2016，54(5):730-735]。

在手性色谱分离领域，sfc在分离速度、分离效率、有机溶剂消耗等方面比hplc具有更为显著的优势。目前未见采用超临界流体色谱法对来那度胺进行手性分离分析的研究报道。因此，开发一种来那度胺对映异构体的超临界流体色谱分离分析方法对于对映体手性分离、药理活性和毒性等相关研究具有积极意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于弥补现有技术中采用超临界流体色谱法对来那度胺对映异构体进行手性色谱分析分离的研究空白，提供一种来那度胺对映异构体超临界流体色谱分离方法。本发明将超临界二氧化碳流体和低级醇的混合物作为流动相，搭配合适的手性固定相，可实现对来那度胺对映异构体的手性色谱分离分析。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种来那度胺对映异构体超临界流体色谱分离方法，包括如下步骤：将来那度胺样品溶于低级醇中，采用超临界流体色谱法在手性固定相上进行手性色谱分析分离；

所述流动相为超临界二氧化碳和低级醇的混合物，所述低级醇为甲醇或乙醇；

所述流动相中超临界二氧化碳和低级醇的体积比为60~75:40~25；

所述手性固定相为硅胶表面涂覆或键合三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定相、硅胶表面键合4-氯苯氨基甲酰化β-环糊精手性固定相或硅胶表面键合3，5-二甲基苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相中的一种。

发明人发现，以超临界二氧化碳和低级醇的混合物作为流动相，在硅胶表面涂覆或键合三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定相，或硅胶表面键合4-氯苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相，或硅胶表面键合3，5-二甲基苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相，通过超临界流体色谱法，能够很好地实现来那度胺对映异构体的手性色谱分离。

优选地，所述手性固定相为硅胶表面涂覆或键合三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定相或硅胶表面键合4-氯苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相中的一种。

优选地，所述流动相中超临界二氧化碳和低级醇的体积比为60~65:35~40。更为优选地，所述流动相中超临界二氧化碳和低级醇的体积比为60:40。

优选地，所述低级醇为甲醇。

优选地，所述来那度胺样品溶于低级醇后，其浓度不大于1.0mg·ml^-1。

优选地，所述来那度胺样品溶于低级醇后，其浓度为0.5mg·ml^-1。

优选地，色谱柱温度不大于55℃。更为优选地，所述色谱柱温度为35℃。

优选地，所述色谱法中流动相的流速为2.5ml·min^-1，进样体积为10μl，紫外检测波长为220nm，背压13.79mpa。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次提供了一种超临界流体色谱分离方法对来那度胺对映异构体进行手性色谱分离分析。本发明提供的超临界流体色谱分离方法，选用超临界二氧化碳和低级醇的混合物为流动相，在硅胶表面涂覆或键合三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉作为手性固定相，或硅胶表面键合4-氯苯氨基甲酰化-β-环糊精作为手性固定相，或硅胶表面键合3，5-二甲基苯氨基甲酰化-β-环糊精作为手性固定相，可实现对来那度胺对映异构体的手性分离，分离时间短，分离效果好，在手性定量分析和制备分离方面具有广阔应用的前景。在优选条件下，来那度胺对映异构体的分离度达到5.05，选择因子为2.94。

附图说明

图1为本发明实施例1得到的来那度胺样品的sfc谱图；

图2为本发明实施例1和5得到的来那度胺样品的sfc谱图；

图3为本发明实施例1、6~8得到的来那度胺样品的sfc谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。

实施例1~12来那度胺对映异构体的超临界流体色谱分离方法

实施例1~12的超临界流体色谱分离方法中，选用的色谱仪为watersacquity超高效合相色谱系统（ultraperformanceconvergencechromatography，upc²），色谱柱规格为150mm×4.6mm，流动相流速为2.5ml·min^-1，来那度胺的浓度为0.5mg·ml^-1，进样体积为10μl，检测波长为220nm。

表1为实施例1~12的来那度胺对映异构体的超临界流体色谱分离方法所选用的其余相关条件及对应的分离结果。其中enantiopakad代表在硅胶表面涂覆三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定相；enantiopakia代表在硅胶表面键合三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定相；enantiopakscdp代表在硅胶表面键合4-氯苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相；enantiopaksdmp代表在硅胶表面键合3，5-二甲基苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相。

表1实施例1~12的超临界流体色谱分离方法的条件设置和分离结果

各实施例提供的来那度胺对映异构体的超临界流体色谱分离方法的具体步骤为：先将来那度胺样品(纯度>98%)用低级醇溶解配制成浓度为0.5mg·ml^-1的溶液，在watersacquityupc²色谱系统上，选用相应的手性固定相，控制流动相组成和色谱柱注温，对来那度胺样品溶液进行手性分离。

由上表1可知，在实施例1~4选用的四种手性固定相中，来那度胺对映体在硅胶表面涂覆三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定相（enantiopakad）上的分离度最大，来那度胺对映体的拆分效果最佳；在硅胶表面键合三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定相（enantiopakia）、硅胶表面键合4-氯-苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相（enantiopakscdp）、硅胶表面键合3，5-二甲基苯氨基甲酰化-β-环糊精手性固定相（enantiopaksdmp）上，来那度胺对映体也实现基线分离，但分离度低于enantiopakad。图1为实施例1得到的来那度胺样品的sfc谱图，由图可知，来那度胺样品分别在4.038min和10.313min出现2个色谱峰，分离度为5.05，分离因子为2.94。

图2为实施例1和实施例5得到的来那度胺样品的sfc谱图，其中meoh代表流动相为超临界二氧化碳与甲醇的混合物；etoh代表流动相为超临界二氧化碳与乙醇的混合物。结果表明，随着流动相中低级醇的极性减小，来那度胺的选择因子和分离度均减小，选用超临界二氧化碳与甲醇的混合物为流动相时，分离效果更为优异。

图3为实施例1、6~8得到的来那度胺样品的sfc谱图。在各体积比的流动相中，随着流动相中低级醇的含量减少，来那度胺的分离度逐渐增大，但来那度胺在色谱柱的保留增强，洗脱时间显著延长。

色谱柱温度变化时，分离结果也呈现规律性变化。随着色谱柱温度的升高，来那度胺的容量因子逐渐减小，更容易被流动相从手性固定相上洗脱；分离度略有增加，但α值随色谱柱温度升高反而降低，说明两组分间的相对保留时间减小。故从手性色谱制备考虑，优选色谱柱温度为35℃。