一种虾青素含量的检测方法与流程

本发明属于化学分析领域，尤其涉及一种虾青素含量的检测方法。
背景技术：
：虾青素属于萜烯类不饱和化合物、是一种酮式类胡萝卜素，广泛存在于虾、蟹、藻类及真菌中，研究表明虾青素在抗氧化、提高免疫力、消除炎症、预防肿瘤、抑制自由基引发的脂质过氧化方面有显著效果，在食品添加剂、保健食品、医药、水产养殖和化妆品等方面有广泛的应用，建立快速、简便、精确的虾青素分析方法有其必要性。虾青素(astaxanthin)，化学名称为3,3’-二羟基-β,β’-胡萝卜素-4,4’-二酮[5]，分子式c40h52o4，相对分子质量为596.86，熔点为216℃，不溶于水，易溶于丙酮、二氯甲烷、乙醚、正己烷等有机溶剂。虾青素分子中有4个异戊二烯单位的共轭双键，是典型的类胡萝卜素碳链结构，虾青素分子中碳原子共轭双键链的两端有羟基和不饱和羰基构成α-羟基酮结构，这一结构具有非常活泼的电子效应，易于清除自由基等氧化成分，天然虾青素非常不稳定，易受到光热酸碱氧化剂的影响而被氧化成虾红素，从而被降解。大量研究证实虾青素具有较强的抗氧化活性，在提高免疫力，预防肿瘤、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病的发生发展，延缓衰老等方面具有积极的促进作用。有研究旨在探讨每日添加虾青素对身体物理性能的影响，研究结果表明，食用添加了虾青素的补充剂对于提高肌肉强度有一定效果，可以提高运动耐力。现虾青素的检测多使用紫外分光光度法。紫外分光光度法是依据美国食品药品监督管理局(fda)官方网站备案资料“analysisoftotalastaxanthininalgaemealpreparedfromhaematococcuspluvialis”的方法制定。但分光光度法会受到样品本底的影响测定结果偏高。本发明所申请方法，具有较好的稳定性和精密度，较低的检出限和定量限，适合于产品中虾青素的检测。由于虾青素具有上述优异的功效，目前已经广泛添加于各种产品中，做成运动营养补剂。为了更好的控制产品的质量，保证产品中虾青素的功效作用，必须对软胶囊中虾青素的含量进行准确检测。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种软胶囊中虾青素含量的检测方法，采用本发明提供的方法对软胶囊中虾青素的含量进行检测时的准确度高。本发明提供了一种软胶囊中虾青素含量的检测方法，包括以下步骤：a)、绘制标准曲线：准确称取全反式虾青素标准品用丙酮溶解并定容，然后稀释成不同浓度，用液相色谱分析仪测定得到虾青素标准曲线。b)、提取：将待测样品，加入二氯甲烷-丙酮溶液，超声混合提取，得到提取液；c)、皂化：向步骤2)得到的提取液中加入氢氧化钠-甲醇溶液，涡旋混匀，充氮密封反应，然后在反应液中加入磷酸-甲醇溶液中和剩余的碱，混匀，过滤膜，得滤液；d)、采用色谱法检测所述滤液中的虾青素含量，得到滤液中虾青素的含量；e)、根据所述滤液中虾青素的含量，得到待测样品中虾青素的含量。优选的，步骤b)中，所述二氯甲烷-丙酮溶液的二氯甲烷和丙酮的体积比为100:1500至100:200，更优选为100:800至100:300，更优选为100:400至100:500。优选的，步骤b)中，所述二氯甲烷-丙酮溶液中可以加入少量的，例如约0.5g的2,6-二叔丁基对甲酚混合后使用，所述2,6-二叔丁基对甲酚作为抗氧化剂有助于减缓虾青素被氧化。优选的，所述待测样品为含有虾青素的片剂、注射剂、气雾剂、丸剂、胶囊剂、散剂或膏剂，优选为胶囊剂，更优选为软胶囊剂。优选的，所述软胶囊待测样品中含有虾青素、葡萄籽油中的一种或多种。优选的，步骤b)中所述待测样品与二氯甲烷-丙酮溶液的用量比为300ml二氯甲烷-丙酮溶液/每g待测样品至1000ml二氯甲烷-丙酮溶液/每g待测样品。更优选地，步骤b)中所述待测样品与二氯甲烷-丙酮溶液的用量比为40ml二氯甲烷-丙酮溶液/每g待测样品至160ml二氯甲烷-丙酮溶液/每g待测样品；进一步优选地，步骤b)中所述待测样品与二氯甲烷-丙酮溶液的用量比为60ml二氯甲烷-丙酮溶液/每g待测样品至160ml二氯甲烷-丙酮溶液/每g待测样品；在本发明中，优选先将所述二氯甲烷和丙酮混合，得到二氯甲烷-丙酮溶液；再将所述软胶囊待测样品与二氯甲烷-丙酮溶液混合。优选的，步骤b)中，所述混合的时间为5～10min。优选的，步骤c)中，所述提取液与氢氧化钠-甲醇溶液体积比为5:1至5:2；所述氢氧化钠-甲醇溶液为称取0.8g氢氧化钠，用甲醇溶解并稀释至100ml，混合后使用；所述涡旋混匀的反应温度为2～6℃，反应时间为12～14h；所述磷酸-甲醇溶液为2ml磷酸和98ml甲醇混匀后使用。优选的，所述步骤d)具体为：d1)、对步骤b)中得到的滤液进行液相色谱检测，得到滤液中虾青素的峰面积；d2)、根据所述滤液中虾青素的峰面积与步骤1)中绘制的虾青素的浓度-峰面积标准曲线对比，得到所述滤液中虾青素的含量。优选的，所述步骤d)中，所述液相色谱检测的色谱柱优选为c30(250×4.6mm，0.5μm)柱；所述液相色谱检测的洗脱方式优选为梯度洗脱；所述液相色谱检测的波长优选为450～500nm，更优选为470～475nm；所述液相色谱检测的流动相的流速优选为0.5～2ml/min，更优选为0.8～1.2ml/min，最优选为1.0ml/min；所述液相色谱检测的柱温优选为20～30℃，更优选为25℃；所述液相谱检测的进样量优选为10～30μl，更优选为20μl。液相色谱检测结束后，得到上清液中虾青素的峰面积。有益效果本发明以二氯甲烷和丙酮作为提取液，提高了提取液对样品中虾青素的提取效果，从而提高了虾青素含量检测的准确度。实验结果表明，采用本发明提供的方法对样品中虾青素的含量进行检测时的专属性良好，重复性、稳定性和回收率的rsd值均在2％以内。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1是本发明实施例1提供的虾青素对照品色谱图；图2是本发明实施例5加标样品的代表性色谱图。具体实施方式在下文中，将参照附图详细地描述本公开的优选的实施方式。在描述之前，应当了解在说明书和所附权利要求中使用的术语，并不应解释为局限于一般及辞典意义，而是应当基于允许发明人为最好的解释而适当定义术语的原则，基于对应于本发明技术层面的意义及概念进行解释。因此，在此的描述仅为说明目的的优选实例，而并非是意指限制本发明的范围，因而应当了解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以做出其他等同实施和修改。此外，除非另有说明，以下公开的试剂和溶剂均为市售产品。使用仪器有高效液相色谱仪(配紫外检测器)，分析天平，超声波清洗机，涡旋混匀器，氮吹仪，棕色容量瓶。使用试剂均为色谱纯，购自国药集团，有丙酮，磷酸，氢氧化钠，甲醇，二氯甲醇，叔丁基甲基醚，2,6-二叔丁基对甲酚(分析纯)。优选的，在步骤c)中，所述提取液与氢氧化钠-甲醇溶液体积比为5ml:1～5ml，更优选为5ml:1～2ml。在本发明中，优选先将碱和甲醇混合配制成碱液，再将所述滤液与碱液混合反应。所述碱液中碱的含量优选为1～5wt％，更优选为2～3wt％。在本发明中，所述滤液与碱混合反应过程中，碱对滤液中的虾青素酯进行皂化，使滤液中的虾青素酯皂化为游离的虾青素。所述反应的温度优选为2～6℃，更优选为3～5℃；所述反应的时间优选为10～20h，更优选为12～14h。反应结束后，得到反应液。对所述反应液进行离心，得到上清液。所述上清液即为后续进行色谱检测时使用的测试样品。得到所述上清液后，采用色谱法检测所述上清液中的虾青素含量，得到上清液中虾青素的含量，该过程具体包括：1)、对所述上清液进行液相色谱检测，得到上清液中虾青素的峰面积；2)、根据所述上清液中虾青素的峰面积与预定的虾青素的浓度-峰面积标准曲线，得到上清液中虾青素的含量。本发明提供的虾青素含量检测方法中所用原辅料均可由市场购得。仪器与设备：高效液相色谱仪(配紫外检测器)：分析天平；超声波清洗机；涡旋混匀器；氮吹仪。试剂：丙酮、二氯甲烷、磷酸、氢氧化钠、甲醇、叔丁基甲基醚、2,6-二叔丁基对甲酚、全反式虾青素、1,3-顺虾青素、9-顺虾青素。在本发明提供的上述采用色谱法对所述上清液进行虾青素含量检测的过程中，首先对所述上清液进行液相色谱检测。其中，本发明对所述液相色谱检测采用的仪器没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的高效液相色谱仪即可(配紫外检测器)。在本发明中，所述液相色谱检测的流动相：梯度洗脱程序见表1。(a为甲醇，b为叔丁基甲基醚，c为1％磷酸溶液。)表1流动相梯度洗脱程序时间/mina/％b/％c/％08115415663042316804271680430811543581154所述液相色谱检测的色谱柱优选为c30(250×4.6mm，0.5μm)柱；所述液相色谱检测的洗脱方式优选为梯度洗脱；所述液相色谱检测的波长优选为450～500nm，更优选为470～475nm；所述液相色谱检测的流动相的流速优选为0.5～2ml/min，更优选为0.8～1.2ml/min，最优选为1.0ml/min；所述液相色谱检测的柱温优选为20～30℃，更优选为25℃；所述液相谱检测的进样量优选为10～30μl，更优选为20μl。液相色谱检测结束后，得到上清液中虾青素的峰面积。得到所述上清液中虾青素的峰面积后，本发明根据所述上清液中虾青素的峰面积与预定的虾青素的浓度-峰面积标准曲线，得到上清液中虾青素的含量。在本发明中，所述预定的虾青素的浓度-峰面积标准曲线优选按照以下方法获得：首先，提供虾青素系列浓度的标准溶液；然后，对所述虾青素系列浓度的标准溶液进行液相色谱检测，得到每个浓度的虾青素标准溶液的色谱图；最后，根据所述色谱图与其对应的虾青素标准溶液的浓度，得到虾青素的浓度-峰面积标准曲线。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：高效液相色谱法检测虾青素含量1、标准溶液配制1.1全反式虾青素标准储备液：准确称取全反式虾青素标准品约10mg，用丙酮溶解并定容于500ml容量瓶中，此溶液浓度为20μg/ml。1.213-顺虾青素标准储备液：准确称取13-顺虾青素标准品约1mg，用丙酮溶解并定容于50ml容量瓶中，此溶液浓度为20μg/ml。1.39-顺虾青素标准储备液：准确称取9-顺虾青素标准品约1mg，用丙酮溶解并定容于50ml容量瓶中，此溶液浓度为20μg/ml。2、标准曲线的配制2.1全反式虾青素标准工作溶液：准确移取适量全反式虾青素标准储备液用丙酮稀释成浓度分别为0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml的标准工作液。2.213-顺虾青素标准工作溶液：准确移取适量13-顺虾青素标准储备液用丙酮稀释成适当浓度的标准工作液。2.39-顺虾青素标准工作溶液：准确移取适量9-顺虾青素标准储备液用丙酮稀释成适当浓度的标准工作液。3、样品前处理3.1提取精密称取虾青素软胶囊样品约50mg～100mg，置于50ml容量瓶中，加入约30ml二氯甲烷-丙酮溶液，超声提取5min，取出，冷却至室温后用二氯甲烷-丙酮溶液(二氯甲烷和丙酮的体积比为100:400，加入0.5g的2,6-二叔丁基对甲酚，混合配制。2,6-二叔丁基对甲酚作为抗氧化剂，减缓虾青素被氧化)定容并混匀，静置30min。准确移取10ml上清液于另一50ml容量瓶中，用二氯甲烷-丙酮溶液稀释并定容，备用。3.2皂化从上述容量瓶中准确移取5ml溶液于10ml比色管中，加入1ml氢氧化钠-甲醇溶液，涡旋混匀，充氮密封，在5℃冰箱中反应12h～14h。然后在反应液中1ml2％磷酸-甲醇溶液中和剩余的碱，混匀，在氮气吹扫下定容至5ml，过0.45μm滤膜，滤液作为试样溶液。4、样品及对照品的测定4.1定性方法分别注入20μl适当浓度的全反式虾青素标准工作液、13-顺虾青素标准工作液、9-顺虾青素标准工作液及试样溶液，按以下色谱条件进行液相色谱分析测定，根据标准工作液色谱图中三种虾青素同分异构体组分的保留时间定性。所述色谱条件：色谱柱为c30(250×4.6mm，0.5μm)柱；洗脱方式优选为梯度洗脱；所述液相色谱检测的波长为470～475nm；所述液相色谱检测的流动相的流速为1.0ml/min；所述液相色谱检测的柱温为25℃；所述液相谱检测的进样量为20μl。4.2定量方法根据试样溶液中虾青素的含量情况，选定峰面积详尽的全反式虾青素的标准工作溶液单点定量或多点校准定量，试样测定结果以三种虾青素同分异构体的总和计，外标法定量，同时标准工作液和样液的响应值均应在仪器检测的线性范围内。5结果计算试样中虾青素的含量(x)以质量分数计(％)，按式(1)计算，保留3位有效数字。x:样品中虾青素含量，％；atrans:试样溶液中全反式虾青素的峰面积；a9-cis:试样溶液中9-顺式虾青素的峰面积；1.1:9-顺式虾青素对全反式虾青素的校正因子；a13-cis:试样溶液中13-顺式虾青素的峰面积；1.3:13-顺式虾青素对全反式虾青素的校正因子；c:标准工作溶液中全反式虾青素的浓度(μg/ml)；v:试样溶液体积，(ml)；as：全反式虾青素标准工作液的峰面积；m:样品称样量，(mg)；f：稀释倍数，为5。图1是本发明实施例1提供的全反式虾青素标准品色谱图(1.0μg/ml)；实施例2：线性范围确认根据实施例1检测方法获得标准品的试验数据，见表2。高效液相色谱法：将全反式虾青素标准工作液进样，按照按以下提供的色谱条件进行液相色谱分析测定，标准溶液浓度和峰面积见表2，其线性回归方程为y＝226168x－10163，相关系数(r2)为0.9999。所述色谱条件：色谱柱为c30(250×4.6mm，0.5μm)柱；洗脱方式优选为梯度洗脱；所述液相色谱检测的波长为470～475nm；所述液相色谱检测的流动相的流速为1.0ml/min；所述液相色谱检测的柱温为25℃；所述液相谱检测的进样量为20μl。表2标准工作液测定数据线性评价：相关系数r2为0.9999，所以用该方法测定虾青素的含量，在浓度为0.165mg/ml至1.320mg/ml之间呈现良好的线性，符合gb/t27404《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求(gb/t27404要求相关系数r2≥0.99)。实施例3：检出限和定量限实验根据实施例1检测方法获得标准品的试验数据，高效液相色谱法：以取样量为100mg，定容体积为50ml，稀释倍数为5，根据3倍信噪比(s/n＝3)标准计算出虾青素的检出限(lod)为0.01％；取标准曲线末端最小点浓度为0.1μg/ml为定量下限，虾青素的定量限为0.025％。实施例4：精密度实验根据实施例1检测方法获得标准品的试验数据，取样品，按照高效液相色谱法做6个平行，测出其中虾青素的含量，结果见表3，高效液相色谱法的rsd＝2.39％，均符合rsd＜2.7％的一般要求，重复性良好。表3高效液相色谱法测定虾青素的相对标准偏差实施例5：加标回收实验本实验选取软胶囊(不添加雨生红球藻粉)作为空白，再按康比特牌雨生红球藻软胶囊中虾青素含量80wt％～120wt％的加标量，分高中低三个浓度进行加标，每个加标水平下做6次平行试验，计算样品中虾青素的回收率，如表4所示，高效液相色谱法的回收率分别为102.4％。图2为根据本实施例加标样品的代表性色谱图(1.5μg/ml)。表4高效液相色谱法加标回收试验结果实施例6：稳定性实验根据实施例1检测方法获得标准品的试验数据，高效液相色谱法：将按照高效液相色谱法制得的试样溶液以每2小时进样1次，计算样品中虾青素的含量，结果见表5；表5高效液相色谱法稳定性试验结果由表5可知，高效液相色谱法的rsd为0.80％，表明该方法24小时内测定的结果具有良好的稳定性。结论：采用根据本发明的检测方法检测虾青素含量，进行线性、精密度试验、稳定性试验、准确度实验，均符合gb/t27404《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，证明本发明的测定方法科学有效，能对虾青素含量测定起到质量控制的目的。对比实施例1：紫外分光光度法检测虾青素含量紫外分光光度法依据美国食品药品监督管理局(fda)官方网站备案资料“analysisoftotalastaxanthininalgaemealpreparedfromhaematococcuspluvialis”的方法制定1材料和方法1.1仪器和试剂1.1.1仪器a)分析天平b)电热恒温水浴锅c)紫外-可见分光光度计1.1.2试剂a)醋酸：分析纯。b)二甲基亚砜：分析纯。1.2检测步骤1.2.1样品溶液处理精确称取样品0.0075g～0.0125g，置于带有刻度的玻璃离心管中；向离心管中加入100ml中含有2.5ml醋酸的二甲基亚砜2ml，摇匀，70℃保温5min，保温过程中要不断摇动离心管；3500r/min离心5min，将上清液移入10ml容量瓶中；再重复4次；将收集的上清液用二甲基亚砜精确定容至10ml，此体积记为v，取1ml放入另一个10ml的容量瓶中，用二甲基亚砜精确定容至10ml，此溶液待测。1.2.2样品测定将待测溶液放入1cm光径比色杯中，在489nm波长下测定吸光值a，用二甲基亚砜溶液做空白对照。1.2.3结果计算式中：x：虾青素的总含量，(％)；a489：489nm下的吸收值；v：提取样品的体积，(ml)；a：稀释倍数；1908：百分吸光系数；m：所称取被测物的质量，(g)。三、高效液相色谱法与紫外分光光度法比较取样品，按照高效液相色谱法和分光光度法分别做6个平行，测出其中虾青素的含量，结果见表6和表7表6高效液相色谱法测定虾青素的相对标准偏差表7分光光度法测定虾青素的相对标准偏差实验结果，分光光度法检测值较高，受样品本底影响。高效液相色谱法检测值更为准确。可见，本发明提供的虾青素测定方法的准确度、精密度和稳定性都达到方法学验证要求，可准确测定虾青素含量。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12