一种同时测定谷物中四种苯甲酸类除草剂的气相色谱法的制作方法

本发明涉及有害痕量物质分析检测的方法，具体涉及到一种同时测定谷物中痕量麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸残留量的气相色谱法。

背景技术：

除草剂是农业生产中的重要物质，对于杀灭有害杂草、提高农产品产量起到了重大的作用，但是随着各类除草剂的广泛使用，除草剂滥用和残留问题也日益突出。其中苯甲酸类除草剂是其中重要的一种，目前市场上销售使用的种类包括麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸等多种，均属于中低毒类除草剂，经口服、皮肤接触等可引起中毒，临床症状轻重不一。

苯甲酸类除草剂属于植物激素类除草剂，具有内吸传导作用，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防效。用于小麦、大米、谷子、水稻等禾本科作物防除猪殃殃、荞麦蔓、藜、牛繁缕、大巢菜、播娘莴、苍耳、薄朔草、田旋花、刺儿菜、问荆、鲤肠、稗草、马唐、看麦娘、狗尾草等。苗后喷雾，药剂通过杂草的茎、叶、根吸收，通过韧皮部及木质部上下传导，阻碍植物激素的正常活动，从而使其死亡。目前我国对麦草畏设定了谷物中的最高残留限量(mrl)为0.5mg/kg，对其他三种化合物尚没有最高残留限量要求。

当前关于食品中涉及该类物质残留量的标准方法主要为《sn/t2228-2008进出口食品中31种酸性除草剂残留量的检测方法气相色谱-质谱法》，其中有规定麦草畏的检测方法，而不涉及对其他几种苯甲酸类除草剂的检测。该标准中检测手段为气相色谱质谱联用法，前处理方法为凝胶渗透色谱法。应用凝胶渗透色谱法进行前处理可以去除大部分的杂质，起到较好的前处理效果，但是该前处理过程存在费时低效、需要耗费大量有机溶剂等诸多缺点，不适应大通量样品的快速筛查检测，亟待需要新的前处理方法来解决快速高效检测筛查的问题。文献报道食品中苯甲酸类除草剂的检测主要涉及到应用气相色谱及气相色谱质谱联用法、高效液相色谱-串联质谱法等，前处理主要集中于采用有机溶剂萃取并使用固相萃取法净化，但使用固相萃取法作为净化手段存在费事低效以及可选择固相萃取材料种类有限的不足。

2011年以来，发明人研究团队对层状双羟基复合金属氧化物(layereddoublehydroxides，ldhs)及其改性材料进行了广泛的研究，制备了不同类插层阴离子改性的ldhs及其焙烧产物(layereddoubleoxide，ldo)材料，并以此为基础运用这些合成材料开展了针对不同目标化合物的吸附富集性能筛选、考察与优化的应用研究。

在前期的研究中发明人应用苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂对水中的多种苯甲酸类除草剂进行了吸附性研究，取得了良好的选择吸附性效果。在此基础上，发明人进一步对所研制的吸附剂富集四种目标化合物的性能和应用方法进行了优化，并根据四种目标物中含有卤素、可以微电子俘获检测器(μecd)上获得良好响应值的特点，建立了以苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物为吸附剂的大米和小麦等谷物中痕量麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸残留量检测的气相色谱法。

技术实现要素：

为了克服现有标准方法中苯甲酸类除草剂残留量检测前处理中使用凝胶渗透色谱费时低效、需要耗费大量有机溶剂、不适应于大通量样品筛查，以及文献方法中使用固相萃取柱耗时低效、固相萃取柱种类有限等诸不足，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于新型吸附剂分散固相萃取快速吸附的、适合于谷物中痕量麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸残残留量同时检测的气相色谱法。

本发明是通过以下技术方案来实现上述目标的。

一种同时测定谷物中四种苯甲酸类除草剂的气相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1化合物的提取和吸附：谷物样品粉碎过60目筛后密封保存，使用时于具塞塑料离心管中称取样品5.00g，向离心管中添加碱性10％丙酮水溶液20ml，密闭并涡旋后超声提取15min，离心，将上清液转移至另一具塞塑料离心管中，重新提取一次并合并提取液；向离心管中添加0.50g苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂，密闭并涡旋后震荡15min使吸附剂吸附提取液中的目标化合物；

步骤2化合物的脱吸附：将具塞离心管中离心，弃去上清液，向其中添加3.00ml的盐酸溶液溶解固体吸附剂，完成被吸附化合物的脱吸附；

步骤3化合物的萃取与衍生化：向上述离心管中添加一定量无水硫酸钠及有机溶剂萃取，涡旋、离心，分取上清液至衍生瓶中，向其中添加0.40ml甲醇和0.2ml浓度为2mol/l的三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液，水浴温度为30℃至50℃，衍生化时间为30min；

步骤4化合物的分析测试：向衍生瓶中添加终止液去除多余衍生剂，并加入适量固体碳酸氢钠和无水硫酸钠，涡旋，吸取上层有机溶液过滤后应用气相色谱法按照下列条件进行分析测试：

a)色谱柱：hp-5毛细管柱，30m×0.32mm，0.25μm膜厚；恒流模式，柱流速：2.00ml/min。

b)进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；进样量：2μl；尾吹气流量：60ml/min。

c)升温程序：70℃(保持1min)，以20℃/min速率升温至150℃(保持0min)，以5℃/min速率升温至180℃(保持5min)，后运行300℃(保持3min)。

d)检测器：电子俘获检测器，温度：325℃。

e)载气：高纯氮气(纯度≥99.999％)。

其中，

步骤1中所述的四种除草剂为麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸，碱性10％丙酮水溶液为用0.01mol/l的氢氧化钠溶液调节ph＝9.0，超声提取时间为15min，吸附的震荡时间为15min。

步骤2中所述的盐酸溶液为浓盐酸与水按照体积比1:1配制而成，用量为3.00ml。

步骤3中添加的无水硫酸钠为2.0g，有机萃取溶剂为5.00ml乙酸乙酯并全取用于衍生化反应。

步骤4中所述的终止液为步骤2中的盐酸溶液，添加量为0.05ml，固体碳酸氢钠添加量为0.1g，无水硫酸钠的添加量为1.0g，滤膜为有机相滤膜，孔径0.22μm。

上述步骤中涡旋为涡旋1min至2min，离心为以4500rpm转速运行3min。

本发明方法研发过程中需要说明的情况：

在方法开发的过程中考虑到麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸等四种除草剂化学性质，可用丙酮、乙酸乙酯、乙腈等有机溶剂提取，同时这四个化合物具有一定的弱酸性，可溶解于碱性水溶液。因此，发明人根据目标物的溶解性特征，结合目标可溶解于有机溶剂和碱性水溶液的特征，选择了可与水溶解的丙酮与水组成混合提取溶剂。由于实验中考察了所用吸附剂所能吸附目标物的最佳ph值范围为4—9，因此使用了0.01mol/l的氢氧化钠溶液调节提取液的ph＝9.0，以增加提取溶剂对目标物的提取效率，减少共提取杂质。

为了使吸附剂对目标物快速完全吸附，实验中根据样品量的大小优化了吸附剂的使用量；发明人在实验中比较了甲醇-硫酸法、甲醇-氢氧化钠、三甲基硅烷化重氮甲烷法等多种衍生化方法，发现使用三甲基硅烷化重氮甲烷法反应条件平和且对四种目标物的衍生化效果最好。

由于四种目标物中均含有卤素原子，在微电子俘获检测器上具有良好的响应值，因此本发明中采用了普及率更高的、配备微电子俘获检测器的气相色谱仪作为检测技术手段。

此外出于对目标物定量准确性考虑，本方法在无法获得目标物同位素从而进行同位素内标法定量的前提下采用基质校正曲线对目标物进行定量，以尽量消除系统误差提高定量的准确性。

本发明的优点在于：

(1)本发明所采用的新型吸附剂苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物可以采用分散固相萃取的方式对提取液中痕量麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸残留量进行快速的吸附，相较于标准方法的凝胶渗透色谱和固相萃取方式可以节省大量的吸附时间；

(2)本发明利用苯磺酸根-镁铝型水滑石吸附剂可溶解于酸的特点，应用盐酸溶液对吸附目标物后的吸附剂进行溶解，可以使得目标物从吸附剂上完全脱吸附；

(3)本发明仅适用少量的有机溶剂作为目标物的萃取溶剂，相较于标准法方法和文献报道方法需要使用大量有机溶剂具有显著的安全、环保优点和经济优势。

附图说明

图1是具体实施方式中麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸残留量的基质标准溶液色谱图，浓度为200.0μg/kg，其中1是麦草畏、2是草芽畏、3是草灭平、4是氯酞酸。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。

(1)本发明实施例中所涉及到的试剂药品如下：

麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸留量共四种化合物固体标准品，纯度大于等于98.0％，德国dr.ehrenstorfergmbh科技股份有限公司；

甲醇，乙酸乙酯，丙酮，无水硫酸钠、氢氧化钠，碳酸氢钠，分析纯，国药集团；

盐酸，优级纯，国药集团；水为符合gb/t6682规定的一级水。

三甲基硅烷重氮甲烷溶液，2.0m溶于正己烷，alfaaesar公司。

实验中所使用的大米和小麦样品均购置福清当地超市，研磨并过60目筛，密封，4℃下保存，使用前取出回温至室温。

(2)本发明实施例中所涉及到的仪器如下：

kh-75a型电热恒温鼓风干燥箱，广州市康恒仪器有限公司；

7890b型气相色谱仪，配电子俘获检测器，美国安捷伦科技有限公司。

(3)气相色谱仪分析测试条件：

a)色谱柱：hp-5毛细管柱，30m×0.32mm，0.25μm膜厚；恒流模式，柱流速：2.00ml/min。

b)进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；进样量：2μl；尾吹气流量：60ml/min。

c)升温程序：70℃(保持1min)，以20℃/min速率升温至150℃(保持0min)，以5℃/min速率升温至180℃(保持5min)，后运行300℃(保持3min)。

d)检测器：电子俘获检测器，温度：325℃。

e)载气：高纯氮气(纯度≥99.999％)。

(4)基质校正曲线的制作和检出限、定量限的确定

准确称量上述麦草畏、草芽畏、草灭平和氯酞酸并以甲醇溶解定容，配制成浓度为1000mg/l的标准储备液，-4℃下保存。使用时将标准储备液以去离子水逐步稀释，配制成浓度梯度为10.0μg/l、20.0μg/l、40.0μg/l、100.0μg/l和200.0μg/l的标准使用液。

在五个50ml具塞离心管中称取空白样品5.00g，分别添加上述标准使用液5.00ml，制备得到系列浓度的基质校正曲线，向离心管中添加ph＝9的碱性10％丙酮水溶液20ml，密闭并涡旋后超声提取15min，离心，将上清液转移至另一50ml具塞塑料离心管中，重新提取一次并合并提取液；向离心管中添加0.50g苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂，密闭并涡旋后震荡15min后使吸附剂吸附提取液中的目标化合物；

将具塞离心管中离心，弃去上清液，向其中添加3.00ml的盐酸溶液(浓盐酸与水按照体积比1:1配制)溶解固体吸附剂，完成被吸附化合物的脱吸附；

向上述离心管中添加2.0g无水硫酸钠及5.00ml乙酸乙酯萃取，涡旋、离心，分取上清液至衍生瓶中，向其中添加0.40ml甲醇和0.20ml浓度为2mol/l的三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液，水浴温度为50℃，衍生化时间为30min；

向衍生瓶中添加0.05ml盐酸溶液(浓盐酸与水按照体积比1:1配制)去除多余衍生剂，并加入固体碳酸氢钠0.1g和无水硫酸钠1.0g，涡旋，静置后吸取上层有机溶液用0.22μm有机相滤膜过滤并应用气相色谱法进行分析测试。

以苯甲酸类除草剂在样品溶液的浓度为x轴，苯甲酸类除草剂衍生物在气相色谱仪上的色谱峰峰面积为y轴绘制基质标准曲线并用于外标法定量。

以信噪比s/n的三倍值为方法的检测限(lod，lod＝3s/n)，以信噪比s/n的十倍为方法的定量限(loq，loq＝10s/n)，并结合添加基质的体积计算各个化合物在水中的检出限和定量限。

上述基质标准曲线相关参数、lod和loq相关信息见表1。

表1.痕量溴苯腈、碘苯腈和羟敌草腈残留量基质标准曲线、检测限和定量限相关信息

(5)苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂的合成

为了是本领域的技术人员能够重复实现本发明的相关实验，现在提供一种本发明中使用的关键物质苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂的合成方法，如下：

①合成吸附剂所涉及到的试剂药品如下：

苯磺酸钠，分析纯，上海韶远试剂有限公司；

mg6al2(oh)16co3·4h2o，分析纯，美国aldrich公司。

②合成吸附剂所涉及到的仪器如下：

excel型微波消解仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司，消解罐体积为100ml；微波马弗炉(烧结炉)，美国cem公司；vd53型真空干燥箱，德国宾德科技公司；hj-5多功能恒温搅拌器，金坛荣华仪器制造有限公司；fs-12型分液漏斗振荡器，日本新光科技有限公司；3k-15型离心机，德国sigma科技公司；bf518945c-1型箱式电阻炉(马弗炉)，美国赛默飞世尔科技公司。

③合成吸附剂的具体步骤如下：

(a)第一次焙烧：将购买的镁铝型水滑石mg6al2(oh)16co3·4h2o置于马弗炉中，以升温速率5℃/min加热至温度为500℃，焙烧6h，得到焙烧产物mg6al2o8(oh)2；

(b)称量：于微波消解罐中称取10.799g插层剂苯磺酸钠和7.236g的焙烧产物mg6al2o8(oh)2。

(c)微波晶化水热合成：将去离子水煮沸并保持30min，之后添加60ml至上述装有插层剂和焙烧产物的微波消解罐中，密闭，将微波消解罐置于微波消解仪中，在130～150℃下微波加热30min完成合成；

(d)洗涤与干燥：将微波罐中的全部固体与液体倒出，以煮沸30min以上的去除二氧化碳的去离子水经加热搅拌、振荡洗涤并离心，90℃下真空干燥12h，研磨保存。

(e)第二次焙烧：将上述合成的苯磺酸根-镁铝型水滑石置于马弗炉中，以升温速率5℃/min加热至温度为500℃，焙烧6h，得到苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂，研磨后密封保存。

实施例1

本实施例1采用大米的空白样品基质进行加标回收实验以验证本发明方法的可行性，按照下列步骤进行处理：

1.化合物的提取吸附：

在50ml具塞离心管中称取空白样品5.00g，并向其中各添加5.00ml浓度分别为10.0μg/l、20.0μg/l和200.0μg/l的四种化合物标准溶液，制备得到三水平六平行的加标样品，向离心管中添加ph＝9的碱性10％丙酮水溶液20ml，密闭并涡旋后超声提取15min，离心，将上清液转移至另一具塞塑料离心管中，重新提取一次并合并提取液；向离心管中添加0.50g苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂，密闭并涡旋后震荡15min后使吸附剂吸附提取液中的目标化合物；

2.化合物的脱吸附：

将上述具塞离心管中离心，弃去上清液，向其中添加3.00ml的盐酸溶液(浓盐酸与水按照体积比1:1配制)溶解固体吸附剂，完成被吸附化合物的脱吸附；

3.化合物的萃取与衍生化：

向上述离心管中添加2.0g无水硫酸钠及5.00ml乙酸乙酯萃取，涡旋、离心，分取上清液至衍生瓶中，向其中添加0.40ml甲醇和0.20ml浓度为2mol/l的三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液，水浴温度为50℃，衍生化时间为30min；

4、分析测试：

向衍生瓶中添加0.05ml盐酸溶液(浓盐酸与水按照体积比1:1配制)去除多余衍生剂，并加入固体碳酸氢钠0.1g和无水硫酸钠1.0g，涡旋，静置后吸取上层有机溶液用0.22μm有机相滤膜过滤并应用气相色谱法进行分析测试。

本实施例1的加标回收率实验相关参数见表2。

表2大米样品的添加浓度及回收率实验数据(n＝6)

实施例2

本实施例2采用小麦的空白样品基质进行加标回收实验以验证本发明方法的可行性，按照下列步骤进行处理：

1.化合物的提取吸附：

在50ml具塞离心管中称取空白样品5.00g，并向其中各添加5.00ml浓度分别为10.0μg/l、20.0μg/l和200.0μg/l的四种化合物标准溶液，制备得到三水平六平行的加标样品，向离心管中添加ph＝9的碱性10％丙酮水溶液20ml，密闭并涡旋后超声提取15min，离心，将上清液转移至另一具塞塑料离心管中，重新提取一次并合并提取液；向离心管中添加0.5g苯磺酸根-镁铝型水滑石焙烧产物吸附剂，密闭并涡旋后震荡15min后使吸附剂吸附提取液中的目标化合物；

2.化合物的脱吸附：

将上述具塞离心管中离心，弃去上清液，向其中添加3.00ml的盐酸溶液(浓盐酸与水按照体积比1:1配制)溶解固体吸附剂，完成被吸附化合物的脱吸附；

3.化合物的萃取与衍生化：

向上述离心管中添加2.0g无水硫酸钠及5.00ml乙酸乙酯萃取，涡旋、离心，分取上清液至衍生瓶中，向其中添加0.40ml甲醇和0.20ml浓度为2mol/l的三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液，水浴温度为30℃，衍生化时间为30min；

4、分析测试：

向衍生瓶中添加0.05ml盐酸溶液(浓盐酸与水按照体积比1:1配制)去除多余衍生剂，并加入固体碳酸氢钠0.1g和无水硫酸钠1.0g，涡旋，静置后吸取上层有机溶液用0.22μm有机相滤膜过滤并应用气相色谱法进行分析测试。

本实施例2的加标回收率实验相关参数见表3。

表3大米样品的添加浓度及回收率实验数据(n＝6)

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围，因此本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。