一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法与流程

本发明涉及一种啶虫脒农药检测方法，特别是一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法。

背景技术：

啶虫脒(n-(n-氰基-乙亚胺基)-n-甲基-2-氯吡啶-5-甲胺)是一种新型杀虫剂，作用于昆虫神经系统突触部位的烟碱乙酰胆碱受体，干扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经系统通路阻塞，造成神经递质乙酰胆碱在突触部位的积累，从而导致昆虫麻痹，最终死亡。啶虫脒用于防治水稻、蔬菜、果树、茶树的翅目及鞘翅目等害虫，因其活性高、用量少、杀虫速效、杀虫谱广、持效期长等特点，被人们广泛应用于农产品和肉制品的害虫防治。由于啶虫脒的广泛使用，它已经广泛存在于人类生活环境中，对人类的身体健康和生存环境造成了极大的潜在威胁。因此，有必要采取措施有效监测农产品和肉制品中啶虫脒农药的含量。

目前啶虫脒农药的检测方法主要有仪器分析方法、酶抑制法、免疫分析法、比色法、化学发光技术、电化学法、荧光法等。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法(gc)、气相色谱-质谱联用(gc-ms)等，仪器分析方法不足之处在于所需仪器设备价格昂贵，需要有专业人员操作，不适合在现场快速检测。酶抑制法的不足之处在于其敏感度和可重复性有待提高，灵敏度不如仪器法。免疫分析法的不足之处在于易产生假阳性。比色法缺陷在于眼睛观察存在主观误差，准确度比较低。利用纳米金比色检测的方法绝大多数是利用其聚集变色效应，容易受到非靶标引起的非特异性聚集影响，尽管最近报道了纳米金过氧化物酶活性来构建传感器检测啶虫脒，其酶作用容易受到环境的干扰。化学发光技术的不足之处在于其信号输出容易受环境的干扰，导致检测结果不可靠。电化学法虽然有很高的灵敏度和特异性，但通常需要对电极进行修饰和需要电化学工作站等一些复杂仪器。目前荧光法主要应用重金属量子点和有机染料作为荧光源，这对环境和人体都存在一定的危害。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法。本方法应用无毒的碳点作为信号分子，纳米金作为淬灭剂，都不需要任何的接枝和修饰，再结合适配体技术，既可以克服传统的缺陷，又可以简便可靠的构建荧光适配体传感器，提高检测的特异性和灵敏度。该方法具有构建方便、灵敏度高、特异性好等优势，可广泛应用于农产品、肉制品等中啶虫脒残留的快速检测。

本发明的技术方案：一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，其特征在于：包括有以下步骤：

a：绘制啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线

a1：制备已知啶虫脒浓度的待测样液，得a1品；

a2：制备空白对照溶液，得a2品；

a3：取a1品和a2品分别用荧光光度计进行扫描测定437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，获得其荧光发射光谱；

a4：根据荧光发射光谱绘制得到啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线；

b、根据啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线建立有关啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的回归方程；

c：制备未知啶虫脒浓度的待测溶液，得c品；

d：取c品用荧光光度计进行扫描测定437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，计算c品与a2品的荧光强度差值，将该荧光强度差值代入线性回归方程中，即可获得c品中啶虫脒的浓度。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述a，绘制啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线的具体方法为：

a1：取多支刻度离心管，每支刻度离心管加入一种已知浓度的啶虫脒标准液和啶虫脒适配体，混匀后孵育，然后加入aunps溶液混匀孵育，接着再加入cds溶液继续孵育，最后加入hepes缓冲液混匀即可制备得到待测样液，为a1品；

a2：取1支刻度离心管，用二蒸水替代已知浓度的啶虫脒标准液，按照a1的方法即可制备得到空白对照溶液，为a2品；

a3：取a1品和a2品分别用荧光光度计进行扫描测定437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，获得其荧光发射光谱；

a4：根据吸收光谱，将不同浓度的a1品与a2品之间的荧光强度差值作为纵坐标，啶虫脒浓度作为横坐标绘制啶虫脒吸光度变化量标准曲线；

所述步骤b中，当啶虫脒浓度为5μg/l≤c≤100μg/l时，啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的回归方程为：y＝2.31c+3.07；

当啶虫脒浓度为100μg/l＜c≤4000μg/l时，

y为荧光强度差值＝含啶虫脒的待测品的荧光强度-a2品的荧光强度；

所述的制备未知啶虫脒浓度的待测溶液c品的具体方法为：

c、用实际样液替代已知浓度的啶虫脒标准液，按照a1的方法即可制备得到未知啶虫脒浓度的待测溶液，为c品。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述的啶虫脒适配体的碱基组成为：5’-tgtaatttgtctgcagcggttcttgatcgctgacaccatattatgaaga-3’，其浓度为25nm。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述的aunps溶液的浓度为3.2nm；cds溶液的浓度为0.2mg·ml^-1。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述的hepes缓冲液ph值为8.0，其浓度为20mm。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述的步骤a3及步骤d中，获得荧光发射光谱的具体方法：取待测品置于石英皿中，用f-4600荧光光度计进行扫描测定437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，获得其荧光发射光谱，波长扫描范围为380-600nm。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述的a1品、a2品或c品制备过程中：加入已知浓度的啶虫脒标准液、二蒸水或实际样液，和啶虫脒适配体混匀后置于25—35℃条件下孵育5—15min，然后加入aunps溶液，混匀后置于25—35℃条件下再孵育5—15min，之后加入cds溶液，混匀后置于25—35℃条件下再孵育5—15min，最后再加入hepes缓冲液混匀。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述的a1品、a2品或c品制备过程中：已知浓度的啶虫脒标准液、二蒸水或实际样液的用量为10.0μl；啶虫脒适配体的用量为5.0μl；aunps溶液的用量为100.0μl；cds溶液的用量为20.0μl；hepes缓冲液的用量为65.0μl，按照上述比例配制。

前述的基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，所述待测样液a1品中啶虫脒浓度维持在5-4000μg/l。

本发明的有益效果：本方法检测原理为：hepes缓冲液体系中，啶虫脒适配体可以吸附和包裹在纳米金表面上，使纳米金表面的负电荷浓度升高并抑制其过氧化物酶活性，加入啶虫脒后，由于适配体与啶虫脒结合并离开纳米金表面，纳米金的过氧化物酶活性得到恢复，在437nm处出现产物特征吸收峰，且荧光强度变化与啶虫脒的浓度成正比，因而该方法可以用于啶虫脒检测。

本方法对啶虫脒的最低检测限为1.08μg·l^-1，具有灵敏度高，特异性好等优点。本检测法构建方便，且操作简单快速，可广泛应用于农产品、肉制品等中啶虫脒残留的快速检测。

如附图4所示，用本发明方法测定当地超市购买的西红柿、黄瓜和白菜，往样品中分别加入100μg/l、1000μg/l、2000μg/l的啶虫脒，得到的回收率为92.6％-105.1％,，证明本方法可靠性。

而从附图3中可以看出，本发明建立的方法可以特异性地检测出啶虫脒，其他竞争性的靶标对啶虫脒的检测几乎无干扰。

附图说明

附图1为加入啶虫脒前后检测体系的荧光强度变化；

图中1:cds；2:aunps+cds；3:aunps+适配体+cds；4:aunps+适配体+cds+500μg/l啶虫脒；5:aunps+适配体+cds+1000μg/l啶虫脒；6:aunps+适配体+cds+2000μg/l啶虫脒

附图2为不同浓度啶虫脒与溶液的荧光变化(δf)的对应关系；

附图3为其它农药对啶虫脒检测的影响示意图；

附图4为应用于实际样品中啶虫脒的检测示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

本发明的实施例1：一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，包括有以下步骤：

a：绘制啶虫脒浓度与荧光强度变化量之间的相互关系标准曲线，该标准曲线如附图2所示，其中包括有以下步骤：

a1:制备已知啶虫脒浓度的待测样液，得a1品。具体方式为：取16支1.5ml刻度离心管，每支刻度离心管加入10.0μl的一种已知浓度的啶虫脒标准液和5.0μl浓度为25nm的啶虫脒适配体，充分混匀后置于25℃条件下孵育15min，然后加入100.0μl的浓度为3.2nm的aunps(纳米金)溶液充分混匀后置于25℃条件下孵育15min，接着再加入20.0μl的浓度为0.2mg·ml^-1的cds(carbondots碳点)溶液充分混匀后置于25℃条件下孵育15min，最后加入65.0μl的浓度为20mm，ph值为8.0的hepes缓冲液混匀即可制备得到待测样液，为a1品。

a2：制备空白对照溶液，得a2品。具体方式为：另取1支1.5ml刻度离心管，用同体积10.0μl二蒸水替代啶虫脒标准液，按步骤a1的方法即可制得空白对照溶液a2品。

a3：将16支不同啶虫脒浓度的待测样液a1品，和1支空白对照溶液a2品置于荧光光度计专用的石英皿中，用f-4600荧光光度计在激发波长为350nm时进行扫描测得437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，获得其荧光发射光谱，如附图1所示。整个扫描过程中波长扫描范围为380-600nm。

a4：根据荧光发射光谱绘制得到啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线。具体绘制方法为，根据吸收光谱，将不同浓度的a1品与a2品之间的荧光强度差值作为纵坐标，啶虫脒浓度作为横坐标绘制啶虫脒吸光度变化量标准曲线。

b、根据啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线建立有关啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的回归方程。当啶虫脒浓度c值为5μg/l≤c≤100时，啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的线性回归方程为：y＝2.31c+3.07；

当啶虫脒浓度为100μg/l＜c≤4000μg/l时，啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的非线性回归方程为：

以上2个方程中y为荧光强度差值＝含啶虫脒的待测品的荧光强度-a2品的荧光强度。故待测样液a1品在制备时，应确保a1品中啶虫脒浓度维持在5-4000μg/l。

c:制备未知啶虫脒浓度的待测溶液，得c品。具体的制备方法为，用同体积的实际样液替代已知浓度的啶虫脒标准液，按照a1的方法即可制备得到未知啶虫脒浓度的待测溶液，为c品。

d:取c品用荧光光度计进行扫描测定437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，计算c品与a2品的荧光强度差值，将该荧光强度差值代入线性回归方程中，即可获得c品中啶虫脒的浓度。具体适用那个方程进行计算，可根据计算得到的c品与a2品的荧光强度差值，当其差值小于等于234时，适用线性方程，大于234时，适用非线性方程。

啶虫脒适配体的碱基组成为：5’-tgtaatttgtctgcagcggttcttgatcgctgacaccatattatgaaga-3’。

本发明的实施例2：一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，包括有以下步骤：

a：绘制啶虫脒浓度与荧光强度变化量之间的相互关系标准曲线，其中包括有以下步骤：

a1:制备已知啶虫脒浓度的待测样液，得a1品。具体方式为：取16支1.5ml刻度离心管，每支刻度离心管加入10.0μl的一种已知浓度的啶虫脒标准液和5.0μl浓度为25nm的啶虫脒适配体，充分混匀后置于30℃条件下孵育10min，然后加入100.0μl的浓度为3.2nm的aunps溶液充分混匀后置于30℃条件下孵育10min，接着再加入20.0μl的浓度为0.2mg·ml^-1的cds溶液充分混匀后置于30℃条件下孵育10min，最后加入65.0μl的浓度为20mm，ph值为8.0的hepes缓冲液混匀即可制备得到待测样液，为a1品。

a2：制备空白对照溶液，得a2品。具体方式为：另取1支1.5ml刻度离心管，用同体积10.0μl二蒸水替代啶虫脒标准液，按步骤a1的方法即可制得空白对照溶液a2品。

a3：将16支不同啶虫脒浓度的待测样液a1品，和1支空白对照溶液a2品置于荧光光度计专用的石英皿中，用f-4600荧光光度计在激发波长为350nm时进行扫描测得437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，获得其荧光发射光谱。整个扫描过程中波长扫描范围为380-600nm。

a4：根据荧光发射光谱绘制得到啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线。具体绘制方法为，根据吸收光谱，将不同浓度的a1品与a2品之间的荧光强度差值作为纵坐标，啶虫脒浓度作为横坐标绘制啶虫脒吸光度变化量标准曲线。

b、根据啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线建立有关啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的回归方程。当啶虫脒浓度c值为5μg/l≤c≤100μg/l时，啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的线性回归方程为：y＝2.31c+3.07；

当啶虫脒浓度为100μg/l＜c≤4000μg/l时，啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的非线性回归方程为：

以上2个方程中y为荧光强度差值＝含啶虫脒的待测品的荧光强度-a2品的荧光强度。故待测样液a1品在制备时，应确保a1品中啶虫脒浓度维持在5-4000μg/l。

c:制备未知啶虫脒浓度的待测溶液，得c品。具体的制备方法为，用同体积的实际样液替代已知浓度的啶虫脒标准液，按照a1的方法即可制备得到未知啶虫脒浓度的待测溶液，为c品。

d:取c品用荧光光度计进行扫描测定437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，计算c品与a2品的荧光强度差值，将该荧光强度差值代入线性回归方程中，即可获得c品中啶虫脒的浓度。具体适用那个方程进行计算，可根据计算得到的c品与a2品的荧光强度差值，当其差值小于等于234时，适用线性方程，大于234时，适用非线性方程。

啶虫脒适配体的碱基组成为：5’-tgtaatttgtctgcagcggttcttgatcgctgacaccatattatgaaga-3’。

本发明的实施例3：一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法，包括有以下步骤：

a：绘制啶虫脒浓度与荧光强度变化量之间的相互关系标准曲线，其中包括有以下步骤：

a1:制备已知啶虫脒浓度的待测样液，得a1品。具体方式为：取16支1.5ml刻度离心管，每支刻度离心管加入10.0μl的一种已知浓度的啶虫脒标准液和5.0μl浓度为25nm的啶虫脒适配体，充分混匀后置于35℃条件下孵育5min，然后加入100.0μl的浓度为3.2nm的aunps溶液充分混匀后置于35℃条件下孵育5min，接着再加入20.0μl的浓度为0.2mg·ml^-1的cds溶液充分混匀后置于35℃条件下孵育5min，最后加入65.0μl的浓度为20mm，ph值为8.0的hepes缓冲液混匀即可制备得到待测样液，为a1品。

a2：制备空白对照溶液，得a2品。具体方式为：另取1支1.5ml刻度离心管，用同体积10.0μl二蒸水替代啶虫脒标准液，按步骤a1的方法即可制得空白对照溶液a2品。

a3：将16支不同啶虫脒浓度的待测样液a1品，和1支空白对照溶液a2品置于荧光光度计专用的石英皿中，用f-4600荧光光度计在激发波长为350nm时进行扫描测得437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，获得其荧光发射光谱。整个扫描过程中波长扫描范围为380-600nm。

a4：根据荧光发射光谱绘制得到啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线。具体绘制方法为，根据吸收光谱，将不同浓度的a1品与a2品之间的荧光强度差值作为纵坐标，啶虫脒浓度作为横坐标绘制啶虫脒吸光度变化量标准曲线。

b、根据啶虫脒浓度与荧光强度变化量标准曲线建立有关啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的回归方程。当啶虫脒浓度c值为5μg/l≤c≤100μg/l时，啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的线性回归方程为：y＝2.31c+3.07；

当啶虫脒浓度为100μg/l＜c≤4000μg/l时，啶虫脒浓度与荧光强度之间相互关系的非线性回归方程为：

以上2个方程中y为荧光强度差值＝含啶虫脒的待测品的荧光强度-a2品的荧光强度。故待测样液a1品在制备时，应确保a1品中啶虫脒浓度维持在5-4000μg/l。

c:制备未知啶虫脒浓度的待测溶液，得c品。具体的制备方法为，用同体积的实际样液替代已知浓度的啶虫脒标准液，按照a1的方法即可制备得到未知啶虫脒浓度的待测溶液，为c品。

d:取c品用荧光光度计进行扫描测定437nm处溶液的发射峰对应的荧光强度，计算c品与a2品的荧光强度差值，将该荧光强度差值代入线性回归方程中，即可获得c品中啶虫脒的浓度。具体适用那个方程进行计算，可根据计算得到的c品与a2品的荧光强度差值，当其差值小于等于234时，适用线性方程，大于234时，适用非线性方程。

啶虫脒适配体的碱基组成为：5’-tgtaatttgtctgcagcggttcttgatcgctgacaccatattatgaaga-3’。

序列表

<110>贵州大学

<120>一种基于碳点荧光内滤效应的啶虫脒农药检测方法

<130>0

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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