荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素C的方法与流程

本发明涉及一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法。

背景技术：

食品中营养物质的分析检测是食品科学研究中的基础技术，食品中的营养物质包括糖类、脂肪类、蛋白质、维生素、无机盐和水六大营养素，维生素c，通常也被称为抗坏血酸（aa），在水果和蔬菜中含量丰富，维生素c可以作为酶的辅助因子、还原剂、神经递质相关酶的组成成分和必要的营养因子，对维持人类正常生理功能十分重要，同时，维生素c在许多领域也被广泛应用，如在食品、动物饲料、饮料、化妆品和药剂配方中作为抗氧化剂，人体内缺乏维生素c可导致各种疾病，包括普通感冒，坏血病，精神疾病，不孕症和癌症，但是，维生素c是一种外源性化学物质，不能在人体中合成，只能从食物中获得，以维持人体所需的含量，因此，维生素c的检测对疾病的诊断和日常生活中的食品营养价值的评价具有重要的意义，迄今为止，国内外已经开发了许多用于检测维生素c的方法，包括滴定法、分光光度法、高效液相色谱法、化学发光法、dpph法和苯肼比色法等，然而，由于需要昂贵的设备和复杂的预处理，限制了它们在快速检测中的使用，因此，非常需要开发用于维生素c检测的简单，灵敏，选择性高和低成本的双功能检测方法，纳米材料由于其独特的性质受到广泛关注，不同的纳米材料已被广泛研究并应用于不同物质的分析检测当中，其中碳纳米材料因具有较好的生物相容性，可调节的激发和发射光谱，高的稳定性，使其成为一种非常有潜力的传感器。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、采用甘氨酸和柠檬酸为原材料，将柠檬酸和甘氨酸溶解在水中，得到混合溶液；

b、将混合溶液放于高压反应釜中，将高压反应釜置于高温条件下加热得到悬浮液；

c、将悬浮液经过离心除去不溶性物质，上层液体通过大孔树脂进行纯化；

d、将纯化的碳纳米材料加热，通过旋转蒸发仪浓缩，冻干后得到纯化的荧光碳纳米材料；

e、以高锰酸钾、十六烷基三甲基溴化钾、吗琳乙磺酸、氢氧化钠为原料和混合液，在室温下混合搅拌制备mno2纳米片；

f、将棕黑色混合液进行离心收集沉淀，去离子水冲洗沉淀，复溶后得到mno2纳米片水溶液；

g、将荧光碳纳米材料水溶液、mno2纳米片水溶液以及缓冲液混合后构筑荧光/核磁双功能探针；

h、向探针体系中加入不同浓度的维生素c水溶液，待反应完成后，用荧光分光光度计测量荧光强度，用核磁共振成像分析仪测量弛豫时间，获得标准曲线。

所述步骤a中柠檬酸和甘氨酸均为0.1-1.0g，水为1-20ml。

所述步骤b中将高压反应釜置于180-250℃条件下加热10-30小时。

所述步骤d中纯化的碳纳米材料加热温度为50-70℃。

所述步骤e中高锰酸钾和十六烷基三甲基溴化钾均为0.5-2g，吗琳乙磺酸、氢氧化钠和混合液调节至ph=5-7，搅拌时间为8-24小时。

所述步骤g中所用的缓冲液为br缓冲液，其组成为硼酸、醋酸、磷酸和氢氧化钠，荧光碳纳米材料水溶液为0.1-1ml，mno2纳米片水溶液为0.1-1ml中，缓冲溶液为0.5-2ml；荧光碳纳米材料浓度为0.1-10mg/ml，mno2纳米片的浓度为100-300μm。

所述步骤h获取的弛豫时间包括横向弛豫时间t2和纵向弛豫时间t1。

所述步骤h中不同浓度的维生素c水溶液的体积为0.2ml，不同浓度的维生素c水溶液中维生素c的浓度范围为0-200μm。

所述步骤h中荧光强度测定时，激发光波长范围是250-360nm，发射光波长范围是300-500nm。

本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法，简单易行，成本低，所得碳纳米材料荧光量子产量高，稳定性较好；mno2纳米片制备过程简单可控，构筑的探针具有较高的检测灵敏性、稳定性及双功能选择性；利用mno2纳米片对碳纳米材料的荧光淬灭作用与维生素c对探针体系荧光强度的恢复以及水分驰豫时间的改变，可以获得维生素c与荧光强度、维生素c与水分驰豫时间的两条标准曲线；检测范围宽，检测限低；提供的维生素c浓度检测方法具有检测过程操作简单方便、灵敏度高且选择性好，检测结果直观、可定量检测的特点。

附图说明

图1是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例一制备的荧光碳纳米材料的透射电镜示意图。

图2是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例一制备的荧光碳纳米材料的粒径分布图。

图3是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例一制备的荧光碳纳米材料的荧光和紫外光谱图。

图4是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例一制备的荧光碳纳米材料的激发和发射光谱，以及实施例二制备的mno2纳米片的发射光谱图。

图5是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例二制备的mno2纳米片的透射电镜示意图。

图6是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例二制备的mno2纳米片的粒径分布图。

图7是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例二制备的不同浓度mno2纳米片对实施例一制备的碳纳米材料的荧光淬灭效果图。

图8是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法施例三探针检测维生素c的荧光标准曲线。

图9是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例四探针检测维生素c的核磁横向弛豫时间标准曲线。

图10是本发明一种荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法实施例四探针检测维生素c的核磁纵向弛豫时间标准曲线。

具体实施方式

如图1至图3所示，高荧光性能荧光碳纳米材料的制备方法，具体包括以下步骤：a、将0.1-1.0g柠檬酸和0.1-1.0g甘氨酸溶解在1-20ml水中；b、将a中所得到的混合溶液放于高压反应釜中，高压反应釜置于烘箱中在高温条件（180-250℃）下加热数小时（10-30h）；c、所得的深棕色悬浮液经离心除去大颗粒后，通过大孔树脂吸附，使用水作为洗脱液纯化粗产物提纯荧光碳纳米材料，树脂吸附所用树脂为d101非极性大孔树脂；d、经纯化的产物通过在50-70℃条件下旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥，得到纯化的荧光碳纳米材料，为白色粉末；e、mno2纳米片的制备方法，将0.5-2g高锰酸钾溶于水中，加入0.5-2g十六烷基三甲基溴化钾不断搅拌，使之溶解；向上一步骤溶液中滴加吗琳乙磺酸与氢氧化钠混合液（ph=6），继续搅拌；f、将上一步骤中的棕黑色混合液进行离心收集沉淀，去离子水冲洗沉淀复溶，重复3-5次，得到mno2纳米片水溶液；g、荧光/核磁双功能探针在维生素c检测中的应用，将荧光碳纳米材料配制成浓度为0.5-2mg/ml的水溶液，将mno2纳米片水溶液稀释为浓度为50-500μm，配制已知浓度的维生素c水溶液，并处理待测样品，取0.5ml荧光碳纳米材料水溶液，0.5mlmno2纳米片水溶液，0.8ml缓冲溶液混合构成探针；h、向上一步骤中加入已经配制好的不同浓度的维生素c水溶液，分别作对照组和实验组，检测实验组中的荧光强度与对照组对比，根据维生素c浓度与对应的荧光强度恢复强度建模，得到维生素c浓度与荧光强度之间的标准曲线；向上一步骤中加入已经配制好的不同浓度的维生素c水溶液，分别作对照组和实验组，检测实验组中的水分驰豫时间与对照组进行对比，根据维生素c浓度与对应的水分驰豫时间建模，得到维生素c浓度与水分驰豫时间之间的标准曲线；将上述步骤中处理好的待测样品溶液加入到探针中，采用与步骤h相同的检测方法，得到待测样品的荧光强度，结合步骤h中得到的标准曲线，得到待测样品的维生素c的浓度；上述步骤中的维生素c的浓度为5-200μm，上述步骤中荧光强度检测的具体条件为采用检测波长范围涵盖280-700nm的荧光分光光度计，激发波长为280-500nm，荧光发射峰的波长为350-690nm，激发波长优选为335nm，发射波长优选为410nm，上述步骤中检测的水分驰豫时间包括横向弛豫时间t2和纵向弛豫时间t1。

实施例一，碳纳米荧光探针的制备：将0.5g柠檬酸和0.5g甘氨酸溶解在10ml水中，然后将溶液转移到聚（四氟乙烯）-衬里的高压釜中，在180℃下在烘箱中加热24小时并自然冷却至室温后，获得含有荧光碳纳米材料的深棕色悬浮液，在5000rpm离心5分钟以除去大颗粒后，使用d101大孔吸附树脂柱，水作为洗脱液纯化粗产物，荧光碳纳米材料通过真空旋转蒸发器浓缩，然后冷冻干燥，得到纯化的荧光碳纳米材料，为白色粉末，通过透射电镜tem如图1，可观察到荧光碳纳米粒子的分散性良好，粒径大小分布在1-5nm之间，如图2，平均大小在2.3nm左右；如图3，荧光光谱显示荧光碳纳米材料的最大激发波长为335nm，最大发射波长为410nm，随着激发波长的增大，光谱有明显的红移现象，如图3，紫外光谱显示在330nm的弱峰值具有n-π^*电子跃迁的现象。

实施例二，mno2纳米片水溶液的制备：将0.5g高锰酸钾充分溶解于500ml去离子水中，向其中加入1.5g十六烷基三甲基溴化钾不断搅拌，不断滴加ph=6的吗琳乙磺酸与氢氧化钠混合液50ml，继续搅拌12h，将得到的棕黑色混合液进行离心（10000rpm5min）收集沉淀，去离子水冲洗沉淀复溶，重复3-5次，得到mno2纳米片水溶液，如图5，通过透射电镜tem可观察到mno2纳米片呈现片状分布，纳米片大小在1.05μm左右，zeta电位为-15.36mv，如图6；固定碳纳米材料的浓度向其中加入不同浓度的mno2纳米片溶液，如图7，可以看到，随着mno2纳米片浓度的增大，碳纳米材料的荧光强度被淬灭的越明显，其原因是mno2纳米片的激发和发射波长范围与碳纳米材料的激发和发射波长范围大部分重合而发生了内滤效应，如图4。

实施例三，维生素c浓度与荧光强度之间的标准曲线的建立：取实施例一中的荧光碳纳米材料，配制成浓度为2mg/ml的碳纳米材料水溶液，取实施例二中的mno2纳米片水溶液稀释成浓度为240μm的mno2纳米片水溶液，配制ph=7的br缓冲液，另取13支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.8ml的ph=7的br缓冲液，然后13支ep管中依次加入0.2ml的浓度为0，5，10，15，20，30，40，50，60，70，80，90，100μm的维生素c水溶液，充分混合后室温下静置2min，采用检测波长范围涵盖280-700nm的荧光光度计检测标准溶液中的荧光强度f1，检测条件为激发波长为335nm，发射波长410nm，空白对照组的荧光强度为f0(激发波长为335nm，发射波长410nm)，绘制出荧光恢复强度（（f-f0）/f0）与维生素c浓度之间的标准曲线，如图8所示，线性回归方程为（f-f0）/f0=0.01079x-0.0681，r²=0.984，根据3σ标准（信噪比）计算维生素c的检测限为2.94μm。

实施例四，维生素c浓度与横向驰豫时间t2之间的标准曲线的建立：取实施例一中的荧光碳纳米材料，配制成浓度为2mg/ml的碳纳米材料水溶液，取实施例二中的mno2纳米片水溶液稀释成浓度为240μm的mno2纳米片水溶液，配制ph=7的br缓冲液，另取13支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.8ml的ph=7的br缓冲液，然后13支ep管中依次加入0.2ml的浓度为0，5，10，15，20，30，40，50，60，70，80，90，100μm的维生素c水溶液，充分混合后室温下静置2min，使用核磁共振成像分析仪检测每个ep管中样品的横向驰豫时间t2，绘制1000/t2与维生素c浓度之间的标准曲线，如图9所示，线性回归方程分别为1000/t2=0.0474x+0.7871，r²=0.997。

实施例五，维生素c浓度与纵向驰豫时间t1之间的标准曲线的建立：取实施例一中的荧光碳纳米材料，配制成浓度为2mg/ml的碳纳米材料水溶液，取实施例二中的mno2纳米片水溶液稀释成浓度为240μm的mno2纳米片水溶液，配制ph=7的br缓冲液，另取5支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.8ml的ph=7的br缓冲液，然后5支ep管中依次加入0.2ml的浓度为0，20，40，60，80μm的维生素c水溶液，充分混合后室温下静置2min，使用核磁共振成像分析仪检测每个ep管中样品的纵向驰豫时间t1，绘制1000/t1与维生素c浓度之间的标准曲线，如图10所示，线性回归方程分别为1000/t1=0.01441x+0.41454，r²=0.995。

实施例六，实际样品的检测：取实施例一中的荧光碳纳米材料，配制成浓度为2mg/ml的碳纳米材料水溶液，取实施例二中的mno2纳米片水溶液稀释成浓度为240μm的mno2纳米片水溶液，配制ph=7的br缓冲液，取1支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml浓度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.8ml的ph=7的br缓冲液，0.2ml的实际样品溶液（脉动饮料），另取一只ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml浓度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.6ml的ph=7的br缓冲液、0.2ml的实际样品溶液（脉动饮料）、0.2ml浓度为20μm的vc标准液，充分混合后室温静置2min，同时作空白对照，测得实际样品组荧光强度为f=1805，加标组荧光强度为2188，空白对照组荧光强度为f0=1450，根据线性回归方程为（f-f0）/f0=0.01079x-0.0681计算出样品组合加标组维生素c浓度分别为29.001μm、53.482μm，加标回收率为122.405%。

实施例七，实际样品的检测：取实施例一中的荧光碳纳米材料，配制成浓度为2mg/ml的碳纳米材料水溶液，取实施例二中的mno2纳米片水溶液稀释成浓度为240μm的mno2纳米片水溶液，配制ph=7的br缓冲液，取1支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.8ml的ph=7的br缓冲液，0.2ml的实际样品溶液（脉动饮料），另取1支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.6ml的ph=7的br缓冲液，0.2ml的实际样品溶液（脉动饮料）、0.2ml浓度为20μm的vc标准液，充分混合后室温下静置2min，测得实际样品组水分横向驰豫时间t2=463.532，加标组水分横向驰豫时间t2=310.587，根据线性回归方程为1000/t2=0.0474x+0.7871计算出实际样品组和加标组维生素c浓度分别为28.95μm、51.21μm，加标回收率为111.337%。

实施例八，实际样品的检测：取实施例一中的荧光碳纳米材料，配制成浓度为2mg/ml的碳纳米材料水溶液，取实施例二中的mno2纳米片水溶液稀释成浓度为240μm的mno2纳米片水溶液，配制ph=7的br缓冲液，取1支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.8ml的ph=7的br缓冲液，0.2ml的实际样品溶液（脉动饮料），另取1支ep管向其中加入0.5ml的2mg/ml的碳纳米材料水溶液、0.5ml度为240μm的mno2纳米片水溶液、0.6ml的ph=7的br缓冲液，0.2ml的实际样品溶液（脉动饮料）、0.2ml浓度为20μm的vc标准液，充分混合后室温下静置2min，测得实际样品组水分纵向驰豫时间t1=1168，加标组水分横向驰豫时间t1=826，根据线性回归方程为1000/t1=0.01441x+0.41454计算出实际样品组和加标组维生素c浓度分别为30.455μm、55.419μm，加标回收率为124.82%。