杀菌止痒洗剂多成分含量测定方法与流程

本发明涉及医药检测领域，具体涉及一种杀菌止痒洗剂多成分含量测定方法。

背景技术：

杀菌止痒洗剂是贵州长生药业独家生产，由黄柏、苦参、蛇床子、土茯苓、冰片、苍术6味中药制备而成，具有清热解毒、杀虫止痒的功效，适用于改善滴虫性、霉菌性、非特异性阴道炎及外阴瘙痒症所致的带下量多、阴痒等症。

目前主要通过测定指标性成分苦参碱的含量和黄柏、蛇床子和冰片的薄层鉴别来控制其质量，然而中药药效的产生是多种化学成分协同作用的结果，因此中药的质量控制也应选择多个化学成分作为检测指标。杀菌止痒洗剂成分较为复杂，仅以苦参碱单一成分作为含量指标成分具有一定的局限性。因此，对杀菌止痒洗剂进行多成分含量测定显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种杀菌止痒洗剂多成分含量测定方法，测定了杀菌止痒洗剂中丹参素、原儿茶酸、金丝桃苷、番泻苷b、迷迭香酸等17种化学成分的含量，能更好的控制杀菌止痒洗剂的质量。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种杀菌止痒洗剂多成分含量测定方法，包括以下步骤：

s1.对照品溶液的制备：

分别精密称取苦参碱、苍术素、盐酸小檗碱、蛇床子素、落新妇苷，溶解于溶剂中，得到对照品储备液。

分别精密量取所述对照品储备液加溶剂稀释，得对照品溶液，备用。

s2.杀菌止痒洗剂样品溶液的制备：

取杀菌止痒洗剂，用三氯甲烷提取得提取液，然后将所述提取液水浴蒸干得残渣，将所述残渣残渣加甲醇溶解定容即得供试品溶液。

s3.含量测定：

采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得对照品溶液和对照品溶液的色谱图；并根据对照品溶液的浓度、对照品溶液在色谱图中的峰面积以及供试品溶液中与对照品溶液相对应成分在色谱图中的峰面积，计算供试品溶液中与对照品溶液相对应成分的含量。

所述检测条件包括：

色谱柱为agilent-zorbaxeclipseplusc18；以体积分数0.05％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱，流动相流速为0.3ml/min；柱温为25～40℃。

优选的，步骤s1中，取苦参碱、苍术素、盐酸小檗碱、蛇床子素、落新妇苷10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配制成每1ml含有苦参碱1.127mg、苍术素0.938mg、盐酸小檗碱1.094mg、蛇床子素0.985mg、落新妇苷1.036mg的对照品储备液。

优选的，分别取所述对照品储备液加入50ml容量瓶定容至刻线，混匀，得浓度分别为(45.62μg/ml、12.15μg/ml、152.46μg/ml、98.65μg/ml、21.82μg/ml)的对照品溶液。

优选的，步骤s2中，取杀菌止痒洗剂，加入甲醇，浴比为1:5，超声处理30min，放冷，加甲醇定容，即得杀菌止痒洗剂样品溶液。

优选的，步骤s2中，取杀菌止痒洗剂5ml加水稀释1～3倍，超声处理10min，放冷，定容至刻线，摇匀，移至分液漏斗中，加入氨水2ml，摇匀；然后用三氯甲烷提取3次，每次25ml，合并三氯甲烷液。

优选的，超声处理条件为功率300w，频率40khz。

优选的，所述梯度洗脱过程中，流动相a和流动相b的变化为：

0min，流动相a80％，流动相b20％；

12min，流动相a75％,流动相b25％；

15min，流动相a64％,流动相b36％；

32.5min，流动相a55％,流动相b45％；

37.5min，流动相a38％,流动相b62％；

45min，流动相a25％,流动相b75％。

优选的，步骤s2中，检测波长为：0～10min(苦参碱)，208nm；10～20min(盐酸小檗碱)，265nm；20～32.5min(落新妇苷)，290nm；32.5～45min(蛇床子素、苍术素)。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1.本发明所提供的测定方法，hplc法具有灵敏度高、抗干扰强、操作简便等优点，能快速高效测定样本中成分的含量。我们采用hplc法系统开展了杀菌止痒洗剂的质量控制研究，测定了杀菌止痒洗剂中丹苦参碱、盐酸小檗碱、落新妇苷、蛇床子素、苍术素5种化学成分的含量，能较全面地考察杀菌止痒洗剂中主要有效成分组成和比例变化情况，节约了时间和提高了检测准确度。

由于混合对照品溶液高效液相色谱图中有五个峰的归属分别为苦参碱、盐酸小檗碱、落新妇苷、蛇床子素、苍术素，因此，在检测杀菌止痒洗剂的有效成分时，不需要再分别制备以上五种成分的各标准品的高效液相色谱图，从而节省了时间和试剂。

可以同时对杀菌止痒洗剂的有效成分中的苦参碱、盐酸小檗碱、落新妇苷、蛇床子素、苍术素这五种成分进行定量检测，能较全面地考察杀菌止痒洗剂中主要有效成分组成和比例变化情况，减少了分析步骤以及减少了样品前处理环节可能引起的成分变化和测定误差。

2.本发明所提供的测定方法，采用高效液相色谱图的方法对杀菌止痒洗剂进行定性和定量的检测，根据杀菌止痒洗剂的有效成分的特性，流动相选择0.05％甲酸水、乙腈，并按程序连续改变流动相中各相之间的比例进行梯度洗脱，可使各成分的色谱峰之间的分离度好，干扰小，峰形好，基线平稳，且较低浓度的酸溶液有利于保护色谱柱；

3.本发明所提供的测定方法，由于各个成分的最大吸收波长差别很大，很难在同一波长较好的表现出来，因此本申请采用多波长同时检测的方式进行测定，并在此基础上对各成分的检测波长进行优选，本发明提供的检测方法运用多波长切换技术，解决了多组分因吸收波长差异大而无法在单一波长下全部检出的矛盾，在保证各成分分别具有较大吸收的同时，减小杂质的干扰，提高各成分色谱峰的专属性，从而进一步提高检测的精确度。

4.本发明所提供的测定方法，具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的优点。

附图说明

图1为本发明实施例1杀菌止痒洗剂样品溶液色谱图；

图2为本发明实施例1对照品溶液色谱图；

图中，1、苦参碱；2、盐酸小檗碱；3、落新妇苷；4、蛇床子素；5、苍术素。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

材料：

本发明实施例使用的仪器见下表1。

表1使用仪器

本发明实施例使用试剂为：

对照品：苦参碱、蛇床子素、落新妇苷、苍术素、盐酸小檗碱标准品，购自中国食品药品检定研究院。各标准品纯度均大于98.0％。

样品：杀菌止痒洗剂批号分别为20170901、20170902、20170903、20170904、20170905、20171001、20171002、20171003、20171004、20171005，由贵州长生药业有限公司提供。

乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)购自美国sigma公司。

实施例1

一种杀菌止痒洗剂多成分含量测定方法，包括以下步骤：

s1.对照品溶液的制备：

取苦参碱、苍术素、盐酸小檗碱、蛇床子素、落新妇苷10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配制成每1ml含有苦参碱1.127mg、苍术素0.938mg、盐酸小檗碱1.094mg、蛇床子素0.985mg、落新妇苷1.036mg的对照品储备液。

分别取所述对照品储备液加入50ml容量瓶定容至刻线，混匀，得浓度分别为(45.62μg/ml、12.15μg/ml、152.46μg/ml、98.65μg/ml、21.82μg/ml)的对照品溶液。

s2.杀菌止痒洗剂样品溶液的制备：

取杀菌止痒洗剂5ml于25ml容量瓶中，加入适量甲醇，密塞，超声30min，取出放冷，用甲醇定容至刻线，即得杀菌止痒洗剂样品溶液。超声处理条件为功率300w，频率40khz。

s3.含量测定：

采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得对照品溶液和对照品溶液的色谱图；并根据对照品溶液的浓度、对照品溶液在色谱图中的峰面积以及供试品溶液中与对照品溶液相对应成分在色谱图中的峰面积，计算供试品溶液中与对照品溶液相对应成分的含量。

所述检测条件包括：

色谱柱为agilent-zorbaxeclipseplusc18；以体积分数0.05％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱，流动相流速为0.3ml/min；柱温为25～40℃。检测波长为：0～10min(苦参碱)，208nm；10～20min(盐酸小檗碱)，265nm；20～32.5min(落新妇苷)，290nm；32.5～45min(蛇床子素、苍术素)。

所述梯度洗脱过程中，流动相a和流动相b的变化为：

0min，流动相a80％，流动相b20％；

12min，流动相a75％,流动相b25％；

15min，流动相a64％,流动相b36％；

32.5min，流动相a55％,流动相b45％；

37.5min，流动相a38％,流动相b62％；

45min，流动相a25％,流动相b75％。

分别取供试品溶液和对照品溶液进hplc测定，色谱图如图1和图2所示，得出杀菌止痒洗剂样品含量测定结果如表2所示。

表2杀菌止痒洗剂样品含量测定结果(mg/片)

实施例2

一种杀菌止痒洗剂多成分含量测定方法，包括以下步骤：

s1.对照品溶液的制备：

取苦参碱、苍术素、盐酸小檗碱、蛇床子素、落新妇苷10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配制成每1ml含有苦参碱1.127mg、苍术素0.938mg、盐酸小檗碱1.094mg、蛇床子素0.985mg、落新妇苷1.036mg的对照品储备液。

分别取所述对照品储备液加入50ml容量瓶定容至刻线，混匀，得浓度分别为(45.62μg/ml、12.15μg/ml、152.46μg/ml、98.65μg/ml、21.82μg/ml)的对照品溶液。

s2.杀菌止痒洗剂样品溶液的制备：

取杀菌止痒洗剂5ml加水稀释3倍，超声处理10min，放冷，定容至刻线，摇匀，移至分液漏斗中，加入氨水2ml，摇匀，用三氯甲烷提取3次，每次25ml，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，即得杀菌止痒洗剂样品溶液。超声处理条件为功率300w，频率40khz。

s3.含量测定：

采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得对照品溶液和对照品溶液的色谱图；并根据对照品溶液的浓度、对照品溶液在色谱图中的峰面积以及供试品溶液中与对照品溶液相对应成分在色谱图中的峰面积，计算供试品溶液中与对照品溶液相对应成分的含量。

所述检测条件包括：

色谱柱为agilent-zorbaxeclipseplusc18；以体积分数0.05％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱，流动相流速为0.3ml/min；柱温为25～40℃。检测波长为：0～10min(苦参碱)，208nm；10～20min(盐酸小檗碱)，265nm；20～32.5min(落新妇苷)，290nm；32.5～45min(蛇床子素、苍术素)。

所述梯度洗脱过程中，流动相a和流动相b的变化为：

0min，流动相a80％，流动相b20％；

12min，流动相a75％,流动相b25％；

15min，流动相a64％,流动相b36％；

32.5min，流动相a55％,流动相b45％；

37.5min，流动相a38％,流动相b62％；

45min，流动相a25％,流动相b75％。

实验例：

1.提取条件考察

提取条件考察

本实验从提取时间、提取料液比、提取溶剂三个方面考察了苦参碱、苍术素、盐酸小檗碱、蛇床子素、落新妇苷提取效率的影响因素。结果见表3。

表3提取条件考察

注：“*”代表料液比

结果表明，料液比为1:5时各成分浓度合适、分离度好，且节约溶剂；提取时间为30min，用甲醇作溶剂时各成分提取率相对最高。因此，选择提取条件定为取杀菌止痒洗剂5ml于25ml容量瓶中，加入适量甲醇，密塞，超声30min，取出放冷，用甲醇定容至刻线。

2.线性关系考察

按照实施例1方法制备对照品溶液，取2μl注入液相色谱仪，分别计算同一保留时间下的峰面积，以浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。计算出标准曲线的回归方程和相关系数。结果表明：各对照品在各自的浓度范围内线性关系良好，线性关系见表4。

表4各指标成分的线性回归方程和线性范围

3.精密度试验

3.1日内精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，进样2μl，重复进样6次，测定含量，计算其rsd。结果表明：日内精密度rsd值范围在0.39～1.12％，说明该法精密度良好，结果见表5。

表5日内精密度试验结果(n＝6)

3.2日间精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，进样2μl，重复进样6次，连续测定三天，每天制备一份供试品溶液，测定各成分的含量，计算其rsd。结果表明：日间精密度rsd值为0.24～0.63％，说明该法精密度良好，结果见表6。

表6日间精密度试验结果(n＝3)(mg/g)

4.重复性试验

平行精密称取6份杀菌止痒洗剂，分别按照实施例1方法制备杀菌止痒洗剂样品溶液6份，将处理好的供试品溶液进行分析，测定各定量成分的含量，计算其rsd值，考察该方法的重现性。结果表明：各成分rsd值范围在0.89～2.43％，表明该方法的重现性良好。结果见表7。

表7杀菌止痒洗剂样品成分含量测定的重复性试验结果(mg/g)

5.稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，在室温下保存，分别于0、2、4、6、8、12h的时间间隔，精密吸取2μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算rsd，考察杀菌止痒洗剂在常温实验条件下稳定性是否良好。结果表明：rsd值范围在0.18～0.93％，表明杀菌止痒洗剂在常温实验条件下稳定性良好，结果见表8。

表8稳定性试验结果(mg/g)

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。