复合玻璃纳米孔道的制备及应用于生物分子检测的制作方法

本发明涉及纳米孔道检测领域，具体涉及一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道复合玻璃纳米孔道的制备方法及其在生物分子检测中的应用。

背景技术：

纳米孔技术作为一种新型的分析检测方法，被广泛应用于核酸测序、蛋白质/多肽分析以及病毒、微生物等生物大分子和金属离子的检测。随着人们对公共安全和食品药品安全等问题的日益关注，对有毒物质的检测也提出了更高的要求。鉴于纳米孔分析方法具有高灵敏度和高选择性等优点，很多研究团队将其应用于有毒物质的检测，进行了很多的研究工作。现阶段的检测手段都是针对单一生物分子进行检测，并且都需要用荧光标记物或生物试剂盒等昂贵的试剂材料，成本高，所需的检测仪器复杂，不利于普及。

目前，单壁碳纳米管被广泛地应用于纳米孔道，单壁碳纳米管的直径约在0.6-2nm之间，具有一定刚性的一维体系且可以稳定存在，其独特的结构决定了它具有非常优异的电学、光学、力学、热学等性质。基于单壁碳纳米管的复合玻璃纳米孔道具有低耗费、高灵敏以及小尺寸等优点，因此被人们广泛地研究并将其应用于生物检测领域。

技术实现要素：

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种复合玻璃纳米孔道的制备方法，该方法基于单臂碳纳米管和磷脂自组装与玻璃纳米孔道，利用组装技术将单壁碳纳米管插在磷脂双分子层表面，再将其修饰道玻璃纳米孔道上，形成复合玻璃纳米孔道。

另外本发明还提供该复合玻璃纳米孔道在生物分子检测中的应用方法。

为实现本发明的第一个目的，其技术方案是一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，具体操作步骤如下：

步骤一：制备玻璃纳米孔道；

步骤二：在步骤一中制备出的玻璃纳米孔道上修饰磷脂；操作方法如下：

①取用100mg的l-α-磷脂酰胆碱溶解于0.700ml的三氯甲烷中，溶解后置于-25℃的冰箱里备用；

②用移液枪取一定量的磷脂溶液，将制备好的玻璃纳米孔道置于溶液中进行修饰；

步骤三：制备复合玻璃纳米孔道，操作方法如下：

①用分析天平称取一定质量的单壁碳纳米管；

②将称取好的swcnt放置于离心小管底部，利用移液枪移取一定体积的磷脂于离心小管中，然后将离心管进行超声分散，分散完成后置于-25℃的条件下备用；

③将步骤二中处理好的玻璃纳米孔道取出，然后利用②中的有swcnt悬浮的磷脂进行修饰，得到复合玻璃纳米孔道。

步骤四：通过皮安计测量出玻璃纳米孔道修饰上插有swcnt的磷脂的电极间的电流数据并记录；

本发明一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，进一步的，所述步骤一中①的玻璃管的规格为外直径：1.2mm；内直径：0.6mm；长度：10mm；步骤一中④的玻璃纳米孔道拉制条件参数如下表一所示，经过sem表征得到的纳米孔径约为1.58μm。

表一玻璃纳米孔道的拉制条件参数表

本发明一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，进一步的，所述步骤二中②取出的磷脂的体积约为20μl，修饰处理时间2-3min。

本发明一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，进一步的，所述步骤三中①所用的swcnt是利用移动催化法得到的纯度>95％，直径<2nm，长度为5-30μm，并称取swcnt的质量范围为0.10mg-0.40mg。

本发明一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，进一步的，所述步骤三中④的超声处理于室温处理时间10-15min；移取的磷脂的体积约为20μl。

本发明一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，进一步的，所述步骤四通过皮安计测量出电极间的电流数据或者生物分子的停留时间进行区分。

本发明的创新机理是：利用了单壁碳纳米管和磷脂，其中单壁碳纳米管形成的纳米孔形貌、孔道完整且其本身拥有卓越的物理性能、纳米级尺寸和化学普遍性；磷脂双分子层具有生物功能性、生物相容性、化学稳定性等特性，该复合孔道结合了无机材料和生物材料的优点。swcnt作为目前研究最热门的一维线性材料，具有许多异常的力学、电学和化学性能，因而是构建电化学生物单壁碳纳米管最好的一维线性材料。

本发明的有益效果体现在：

1.本发明提供一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，利用玻璃拉制仪拉制一定规格的玻璃纳米孔道，然后通过超声的方法使得单壁碳纳米管插入磷脂内，然后将插有磷脂的玻璃碳纳米管修饰到玻璃纳米孔道上形成复合的玻璃纳米孔道。无需超声切割长时间纯化的swcnt，也无需利用微注射探针使得swcnt插入磷脂双分子层，方法简单。可以通过复合玻璃纳米孔道特异性孔道对不同生物大分子的电流信号改变进行测量，适用于检测其他不同的目标分子，具有普适性，更利于推广使用。单壁碳纳米管形成的纳米孔形貌、孔道完整且其本身拥有卓越的物理性能、纳米级尺寸和化学普遍性；磷脂双分子层具有生物功能性、生物相容性、化学稳定性等特性，构建出基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道。

2.本发明提供一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，以单壁碳纳米管为纳米孔道，由于碳纳米管自身具有一定导电能力，能灵敏地检测到生物分子大小的变化，进而通过自身电导的改变实现电信号转化，进一步提高了单壁碳纳米管的灵敏度和检测下限，而包裹单壁碳纳米管的磷脂又具有优良的生物特性。因此得到的复合玻璃纳米孔道对生物分子检测具有灵敏度高、分析速度快、仪器简单、成本低、便携以及能实现原位实时检测等优点。

3.可以通过在磷脂中插入不同质量的单壁碳纳米管然后修饰道玻璃纳米孔道上，这适用于检测其他不同的目标分子，不需要用到荧光标记物及生物试剂盒等昂贵的试剂材料，具有普适性，更利于推广使用。

4.本发明提供一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法，构建了复合玻璃纳米孔道，可以实现器件的重复检测使用，对同一样品，可以分别检测多个不同的目标分子。

5.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1为本发明提供一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备流程图；

图2为生物分子检测装置图；

图3为皮安计检测分别通过玻璃纳米孔道，组装上磷脂的玻璃纳米孔道，组装上插入不同质量swcnt的磷脂的复合玻璃纳米孔道的电流图；

图4为皮安计检测分别通过组装上插入不同质量swcnt的磷脂的复合玻璃纳米孔道的电流数据比较图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

步骤一：制备玻璃纳米孔道；操作方法如下：

①取一支规格为外直径：1.2mm；内直径：0.6mm；长度：10mm的玻璃管备用；

②将玻璃管置于体积比为1:1的浓硫酸(h2so4),过氧化氢(h2o2)混合溶液中，超声15min左右。用高纯水、乙醇冲洗，后将其置于高纯水中备用；

③用镊子将洗净的玻璃管夹出，以乙醇冲洗，并用氮气吹干，备用；

④再将玻璃管在设置了一定参数的玻璃管拉制仪上拉制成合适孔径的玻璃纳米孔道(参数如上所述表一所示)，经过sem表征得到的纳米孔径约为1.58μm。

步骤二：在步骤一中制备出的玻璃纳米孔道上修饰磷脂；操作方法如下：

①取用100mg的l-α-磷脂酰胆碱溶解于0.700ml的三氯甲烷中，溶解后置于-25℃的冰箱里备用；

②用移液枪取约20μl的磷脂溶液，将制备好的玻璃纳米孔道置于溶液中2-3min利用毛细管现象对玻璃纳米孔道进行修饰；

步骤三：制备复合玻璃纳米孔道，操作方法如下：

①用分析天平称取质量梯度为0.10mg，0.20mg，0.30mg，0.40mg的单壁碳纳米管；

②将称取好的swcnt放置于离心小管底部，利用移液枪移取20μl的磷脂于离心小管中，然后将离心管在室温条件下超声分散处理时间10-15min，分散完成后置于-25℃的条件下备用；

③将步骤二中处理好的玻璃纳米孔道取出，然后利用②中的有swcnt悬浮的磷脂进行修饰2-3min，得到复合玻璃纳米孔道。

步骤四：通过皮安计测量出玻璃纳米孔道修饰上插有swcnt的磷脂的电极间的电流数据并记录。

如图2所示，利用两根ag/agcl电极构成双电极体系，然后将制得的复合玻璃纳米孔道如图所示组装到其中一根通过ag/agcl电极，最后将两个电极置于装有缓冲液的电解池中，分别用皮安计对其进行电流的检测并记录。缓冲液为10mm的hepes溶液(ph＝7.03，0.1mnacl),所以移取的缓冲溶液的体积为6.0ml。

按照上述方法制备实施例1～4，反应条件如下表二所示：

表二实施例1～4的反应条件

ag/agcl二电极体系的检测装置如图2，每对ag电极在使用之前必须用naclo溶液进行预处理从而得到ag/agcl电极材料。将两个电极置于装有6.0ml缓冲液为10mm的hepes溶液(ph＝7.03，0.1mnacl)的电解槽中，分别用皮安计和膜片钳对其进行电流的检测并记录。未经任何修饰的玻璃纳米孔道，通过皮安计可以测得其电极间的电流大小，此时使用的是+2v的交流电压进行检测通过纳米孔的电流大小。由于玻璃纳米孔道的孔径为微米级别，测得的为大电流；将玻璃纳米孔道用磷脂溶液处理，由于生物磷脂将原本的玻璃纳米孔道封住，此时测得的是小电流；进一步用插入不同质量梯度的swcnt的磷脂溶液修饰的玻璃纳米孔道之后，得到的电流数据处在小电流和大电流之间，并且随着质量不断增加电流逐渐变大。通过电流数据比对，如果得到电流介于小电流和大电流之间，则可以证明有单壁碳纳米管插入磷脂；若电流是小电流，则证明单壁碳纳米管没有插入到磷脂双分子层。

本发明提供的基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道，ag/agcl电极间hepes缓冲溶液和复合玻璃纳米孔道连接，利用缓冲液中na⁺在纳米孔之间的移动进行电流传输，磷脂溶液可以限制一定量的na⁺通过，从而得到小电流变化的数据。而swcnt插入磷脂时可以作为离子通道灵敏地捕捉到na⁺通过时的电信号的增加，进一步提高了灵敏度和检测下限。

具体的检测步骤：

将复合玻璃纳米孔道与ag/agcl电极连用作为闭合电路的检测器，通过皮安计测量其电流变化。检测生物分子示例：将实施例2中制备的复合玻璃纳米孔道如图2所示与ag/agcl电极组合，在电解槽中加入6.0ml缓冲液为10mm的hepes溶液(ph＝7.03，0.1mnacl)。如图3组装上插入不同质量swcnt的磷脂的复合玻璃纳米孔道的电流曲线和通过玻璃纳米孔道，组装上磷脂的玻璃纳米孔道的电流曲线对比所示。如果电极间的电流是大电流，说明swcnt已经成功插入磷脂中形成纳米离子通道。如果电极间电流是小电流，则说明swcnt未插入磷脂。

综上，本发明是一种基于单臂碳纳米管(swcnt)和磷脂自组装的玻璃纳米孔道，通过电信号转换检测生物分子的复合玻璃纳米孔道的制备方法成功构建了复合玻璃纳米孔道，通过利用该复合纳米孔道可以对dna，rna，蛋白质，金属离子等生物大分子进行检测。由于单壁碳纳米管具有的直径约为0.5-2nm，当有目标分子通过单壁碳纳米管，利用皮安计检测的电流数据可对特定的生物分子进行一定的区分作用，因而具有更高的灵敏度。同时具有分析速度快、仪器简单、成本低、便携以及能实现原位实时检测等优点。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。