一种荷丹片中多种有效成分的含量测定方法与流程

本发明属于药学领域，涉及药品质量的测定方法，具体涉及一种荷丹片中多种有效成分的含量测定方法。

背景技术：

荷丹片为中成药。为理血剂，具有化痰降浊，活血化瘀之功效。主治高脂血症属痰浊挟瘀证候者。荷丹片由荷叶，丹参，山楂，番泻叶，补骨脂(盐炒)等中药原料加工制成。

荷丹片质量标准收载于2015版《中国药典》，药典中质量标准仅对复方中的荷叶碱进行了含量测定。然而中药药效的产生是多种化学成分协同作用的结果，因此中药的质量控制也应选择多个化学成分作为检测指标。荷丹片成分较为复杂，单一成分作为指标成分具有一定的局限性。因此，对荷丹片进行多成分含量测定显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种荷丹片中多种有效成分的含量测定方法。

本发明所述的有效成分包括：补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷b、紫云英苷、番泻苷a、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、荷叶碱、丹酚酸a、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸c、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚。

本发明所述的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

取荷丹片各标准品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成每1ml含有适量补骨脂苷(po)、异补骨脂苷(ipo)、金丝桃苷(hyp)、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷(qug)、异槲皮苷(iq)、番泻苷b(seb)、紫云英苷(ast)、番泻苷a(sea)、迷迭香酸(roa)、紫草酸(lia)、丹酚酸b(sab)、荷叶碱(nuc)、丹酚酸a(saa)、补骨脂素(p)、异补骨脂素(ip)、丹酚酸c(sac)、大黄酸(rhe)、新补骨脂异黄酮(neo)、补骨脂宁(cor)、隐丹参酮(cry)、补骨脂酚(bak)的对照品储备液；

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷b、紫云英苷、番泻苷a、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、荷叶碱、丹酚酸a、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸c、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品储备液至容量瓶中，甲醇定容，混匀，得到混合对照品储备液；

(2)供试品溶液的制备

取荷丹片，粉碎，置于容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量离心，移取上清液至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液；

(3)色谱条件

吸取混合对照品储备液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中有效成分的含量；

色谱条件：色谱柱c18、流速0.1-0.6ml/min；柱温20-60℃，以甲酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱。

其中，(1)对照品溶液的制备：取荷丹片各标准品适量，精密称定，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成每1ml含有补骨脂苷(po)2.058mg、异补骨脂苷(ipo)2.290mg、金丝桃苷(hyp)1.988mg、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷(qug)2.014mg、异槲皮苷(iq)2.152mg、番泻苷b(seb)1.082mg、紫云英苷(ast)1.102mg、番泻苷a(sea)0.224mg、迷迭香酸(roa)1.064mg、紫草酸(lia)1.228mg、丹酚酸b(sab)2.144mg、荷叶碱(nuc)1.012mg、丹酚酸a(saa)1.120mg、补骨脂素(p)0.999mg、异补骨脂素(ip)2.072mg、丹酚酸c(sac)0.348mg、大黄酸(rhe)0.990mg、新补骨脂异黄酮(neo)1.004mg、补骨脂宁(cor)1.044mg、隐丹参酮(cry)1.080mg、补骨脂酚(bak)1.338mg的对照品储备液；

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷b、紫云英苷、番泻苷a、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、荷叶碱、丹酚酸a、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸c、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品储备液适量至10ml容量瓶中，甲醇定容，混匀，得浓度分别为：137.0μg/ml、78.23μg/ml、133.6μg/ml、165.4μg/ml、75.59μg/ml、6.372μg/ml、24.78μg/ml、8.212μg/ml、16.04μg/ml、16.73μg/ml、211.5μg/ml、53.81μg/ml、35.04μg/ml、21.42μg/ml、31.64μg/ml、5.907μg/ml、22.48μg/ml、4.030μg/ml、0.891μg/ml、13.29μg/ml、9.904μg/ml的混合对照品储备液。

其中，(2)供试品溶液的制备：

取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于10-50ml容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理10-25min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量离心，精密移取上清液5ml至10ml容量瓶中，加25-100％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。

优选的，(2)供试品溶液的制备：

取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理15min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量14000rpm离心10min，精密移取上清液5ml至10ml容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。

其中，(3)测定方法中，色谱条件：采用色谱柱acquitybehc18、流速0.3ml/min；柱温40℃，以甲酸水溶液和乙腈作为流动相，进行梯度洗脱。

梯度洗脱过程如下：

优选的，本发明所述的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

取荷丹片各标准品适量，精密称定，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成每1ml含有补骨脂苷(po)2.058mg、异补骨脂苷(ipo)2.290mg、金丝桃苷(hyp)1.988mg、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷(qug)2.014mg、异槲皮苷(iq)2.152mg、番泻苷b(seb)1.082mg、紫云英苷(ast)1.102mg、番泻苷a(sea)0.224mg、迷迭香酸(roa)1.064mg、紫草酸(lia)1.228mg、丹酚酸b(sab)2.144mg、荷叶碱(nuc)1.012mg、丹酚酸a(saa)1.120mg、补骨脂素(p)0.999mg、异补骨脂素(ip)2.072mg、丹酚酸c(sac)0.348mg、大黄酸(rhe)0.990mg、新补骨脂异黄酮(neo)1.004mg、补骨脂宁(cor)1.044mg、隐丹参酮(cry)1.080mg、补骨脂酚(bak)1.338mg的对照品储备液；

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷b、紫云英苷、番泻苷a、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、荷叶碱、丹酚酸a、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸c、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品储备液适量至10ml容量瓶中，甲醇定容，混匀，得浓度分别为：137.0μg/ml、78.23μg/ml、133.6μg/ml、165.4μg/ml、75.59μg/ml、6.372μg/ml、24.78μg/ml、8.212μg/ml、16.04μg/ml、16.73μg/ml、211.5μg/ml、53.81μg/ml、35.04μg/ml、21.42μg/ml、31.64μg/ml、5.907μg/ml、22.48μg/ml、4.030μg/ml、0.891μg/ml、13.29μg/ml、9.904μg/ml的混合对照品储备液。

(2)供试品溶液的制备

取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理15min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量14000rpm离心10min，精密移取上清液5ml至10ml容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液；

(3)测定方法：

吸取混合对照品储备液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中有效成分的含量；

色谱条件：采用色谱柱acquitybehc18、流速0.3ml/min；柱温40℃，以0.1％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱过程如下：

本发明的有益效果：本发明建立的液相色谱测定荷丹片中21种有效成分的含量的方法，符合方法学验证的要求，并操作简便，灵敏度高，测定准确，适用性强，能够用于对该产品的质量控制。同时，填补了该产品定量控制的空白，使得对该产品能够进行更有效的质量分析，更全面反映产品的质量状况，保证该产品的质量稳定性。

附图说明

图1、荷丹片样品溶液、对照品溶液色谱图

(1、补骨脂苷；2、异补骨脂苷；3、金丝桃苷；4、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷；5、异槲皮苷；6、番泻苷b；7、紫云英苷；8、番泻苷a；9、迷迭香酸；10、紫草酸；11、丹酚酸b；12、荷叶碱；13、丹酚酸a；14、补骨脂素；15、异补骨脂素；16、丹酚酸c；17、大黄酸；18、新补骨脂异黄酮；19、补骨脂宁；20、隐丹参酮；21、补骨脂酚)注：因流动相有杂质的缘故，混合对照品溶液中含有较多杂峰，但不影响所测化合物。

图2不同色谱柱分析样品的uplc色谱图

图3不同流动相条件下样品分析的uplc色谱图

图4不同柱温条件下样品分析的uplc色谱图

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。

实施例1、

1材料与方法

1.1仪器

1.2试药

对照品：

荷丹片样品，批号分别为：20170507(用于方法学研究)、20171006、20171102、20171105、20171107、20171109、20171112、20171201、20180101、20180103、20180105，由南昌济顺制药有限公司提供。

1.3试剂

1.4方法

1.4.1色谱条件

采用色谱柱acquitybehc18(2.1×100mm，1.7μm，美国waters公司)、流速0.3ml/min；柱温40℃，考察乙腈–0.1％甲酸水溶液体系不同比例下对荷丹片各成分分离的影响。最终确定的梯度洗脱程序见下表1，各候选成分检测波长见表2。表

表1流动相梯度洗脱条件

表2各化合物检测波长

1.4.2对照品溶液的制备

取荷丹片各标准品适量，精密称定，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成每1ml含有补骨脂苷(po)2.058mg、异补骨脂苷(ipo)2.290mg、金丝桃苷(hyp)1.988mg、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷(qug)2.014mg、异槲皮苷(iq)2.152mg、番泻苷b(seb)1.082mg、紫云英苷(ast)1.102mg、番泻苷a(sea)0.224mg、迷迭香酸(roa)1.064mg、紫草酸(lia)1.228mg、丹酚酸b(sab)2.144mg、荷叶碱(nuc)1.012mg、丹酚酸a(saa)1.120mg、补骨脂素(p)0.999mg、异补骨脂素(ip)2.072mg、丹酚酸c(sac)0.348mg、大黄酸(rhe)0.990mg、新补骨脂异黄酮(neo)1.004mg、补骨脂宁(cor)1.044mg、隐丹参酮(cry)1.080mg、补骨脂酚(bak)1.338mg的对照品储备液。

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷b、紫云英苷、番泻苷a、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、荷叶碱、丹酚酸a、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸c、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品储备液适量至10ml容量瓶中，甲醇定容，混匀，得浓度分别为：137.0μg/ml、78.23μg/ml、133.6μg/ml、165.4μg/ml、75.59μg/ml、6.372μg/ml、24.78μg/ml、8.212μg/ml、16.04μg/ml、16.73μg/ml、211.5μg/ml、53.81μg/ml、35.04μg/ml、21.42μg/ml、31.64μg/ml、5.907μg/ml、22.48μg/ml、4.030μg/ml、0.891μg/ml、13.29μg/ml、9.904μg/ml的混合对照品储备液。

1.4.3供试品溶液的制备

取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理(功率500w，频率40khz)15min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量14000rpm离心10min，精密移取上清液5ml至10ml容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。

实施例2

2实验结果

2.1荷丹片多成分含量测定

2.1.1供试品溶液制备方法的优化

本实验从提取溶剂、提取时间、提取料液比三个方面考察了荷丹片中补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、荷叶碱、丹酚酸a、补骨脂素、异补骨脂素、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚提取效率的影响因素。番泻苷b、番泻苷a、丹酚酸c含量低于检测限，不作为提取条件考察的指标成分。考察结果见表3。

表3荷丹片中21个候选指标成分提取条件优化(mg/g，n＝2)

注：“–”表示低于检测限。

结果表明，料液比为1:50时指标成分的提取效率高，且相对节约试剂；提取时间为15min时各成分提取充分且时间较短；用甲醇作溶剂时各成分提取率相对最高。因此，选择提取条件定为取荷丹片粉末0.5g于25ml容量瓶中，加入适量甲醇，超声15min，取出放冷，用甲醇定容至刻线，密塞摇匀，14000rpm离心10min，取上清液5ml至10ml容量瓶中，50％甲醇定容至刻度，混匀，即得。

实施例3

2.1.2方法学研究

2.1.2.1线性关系考察

将“1.4.2项”下混合对照品溶液用50％甲醇逐级稀释为一系列混合对照品溶液，取2μl注入超高效相色谱仪中，记录各指标成分峰面积，以化合物浓度x为横坐标，以化合物峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。计算标准曲线的回归方程和相关系数。结果表明：各对照品在各自的浓度范围内线性关系良好，线性关系见表4。

表4各指标成分的线性回归方程和线性范围、检测限和定量限

2.1.2.2精密度试验

日内精密度试验：

按照“1.4.3项”下方法制备一份荷丹片供试品溶液，按照“1.4.1项”下的方法进行检测，重复进样6次，测定其峰面积，计算rsd值。结果表明：日内精密度rsd值范围在0.57～2.10％，说明该方法精密度良好，结果见表5。

表5荷丹片中21个候选指标成分日内精密度试验结果(n＝6，峰面积)

注：“–”表示低于检测限。

日间精密度试验：

按照“1.4.3项”下方法制备一份荷丹片供试品溶液，按照“1.4.1项”下的方法进行检测，重复进样6次，连续制备三天，测定三天各成分的峰面积，计算其rsd。结果表明：日间精密度rsd值为0.60％～1.93％，说明该法精密度良好，结果见表6。

表6荷丹片中21个候选指标成分日间精密度试验结果(n＝3，a/g)

注：“–”表示低于检测限。

2.1.2.3重复性试验

取荷丹片粉末0.5g，精密称定，平行6份，分别按照“1.4.3项”下方法制备荷丹片供试品溶液，按照“1.4.1项”下的方法进行检测分析，测定各指标成分的含量，计算其rsd值，考察该方法的重现性。结果表明：补骨脂苷的含量为1.604mg/g、异补骨脂苷的含量为0.996mg/g、金丝桃苷的含量为1.667mg/g、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷为2.044mg/g、异槲皮苷的含量为0.952mg/g、紫云英苷的含量为0.341mg/g、迷迭香酸的含量为0.209mg/g、紫草酸的含量为0.203mg/g、丹酚酸b的含量为2.395mg/g、荷叶碱的含量为0.656mg/g、丹酚酸a的含量为0.404mg/g、补骨脂素的含量为0.330mg/g、异补骨脂素的含量为0.406mg/g、大黄酸的含量为0.069mg/g、新补骨脂异黄酮的含量为0.050mg/g、补骨脂宁的含量为0.011mg/g、隐丹参酮的含量为0.196mg/g、补骨脂酚的含量为0.122mg/g；rsd值范围在0.18～3.27％，表明该方法的重现性良好，结果见表7。

表7荷丹片中21个候选指标成分的重复性试验结果(mg/g，n＝6)

注：“–”表示低于检测限。

由重复性结果可知，荷丹片中所测各化合物重复性结果相对较好，个别化合物因含量较低，存在一定系统误差，使得rsd结果偏大。

2.1.2.4稳定性试验

按照“1.4.3项”下方法制备一份荷丹片供试品溶液，按照“1.4.1项”下的方法进行检测，分别于0、2、4、6、8、10、12h的时间间隔，精密吸取2μl，注入超高效液相色谱仪，测定其含量，计算rsd，考察荷丹片在实验条件下12h内稳定性是否良好。结果表明：rsd值范围在0.36～2.68％，表明荷丹片在常温实验条件下放置12h稳定性良好，结果见表8。

表8荷丹片中21个候选指标成分的稳定性试验结果(mg/g，n＝7)

注：“–”表示低于检测限。

2.1.2.5加样回收率试验

称取荷丹片样品0.25g，平行六份，精密称定，以重复性结果计算样品中各化合物的原始量，加入与样品中各成分质量相当的混合对照品溶液(其中补骨脂苷82.32μg/ml、异补骨脂苷45.80μg/ml、金丝桃苷79.52μg/ml、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷100.70μg/ml、异槲皮苷43.04μg/ml、番泻苷b8.66μg/ml、紫云英苷17.63μg/ml、番泻苷a1.79μg/ml、迷迭香酸10.64μg/ml、紫草酸9.82μg/ml、丹酚酸b128.64μg/ml、荷叶碱32.38μg/ml、丹酚酸a22.40μg/ml、补骨脂素15.98μg/ml、异补骨脂素20.72μg/ml、丹酚酸c2.78μg/ml、大黄酸3.96μg/ml、新补骨脂异黄酮2.41μg/ml、补骨脂宁0.63μg/ml、隐丹参酮10.80μg/ml、补骨脂酚5.35μg/ml)5ml，用移液管精密移取。按“1.4.3项”下方法制备供试溶液，按照“1.4.1项”下的方法进行检测分析，并计算各成分回收率。各成分回收率范围在91.36％～111.62％，rsd均不大于3.41％，结果见表9。

表9荷丹片中21个候选指标成分的加样回收率结果(n＝6)

注：“–”表示低于检测限。

经过系统的方法学研究表明，21个化合物的线性关系良好，r均大于0.994；除化合物番泻苷b、番泻苷a、丹酚酸c(低于检测限)外，其余化合物日内精密度rsd值范围在0.57～2.10％，日间精密度rsd值为0.60～1.93％；重复性的rsd值范围在0.18～3.27％；21个化合物的平均回收率为91.36～111.62％，rsd值范围在0.41％～3.41％；稳定性的rsd值范围在0.36～2.68％，结果表明：该方法日内、日间精密度、重复性及稳定性良好，符合相关方法学的要求，可用于样品的含量测定。分别取样品溶液和混合对照品溶液注入uplc进行测定。荷丹片供试品溶液与混合对照品溶液色谱图见图1。

2.1.2.6荷丹片或多批次含量测定

按照“1.4.3”项下的制备方法制备10批供试品溶液，每批平行两份。以“1.4.1”项下的色谱方法进行检测，检测结果见表10。

由表10可知，10批次含量测定中，含量最高的成分依次是丹酚酸b(3.556mg/g～4.516mg/g)、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷(3.096mg/g～4.303mg/g)、金丝桃苷(2.322mg/g～3.636mg/g)、补骨脂苷(2.164mg/g～2.474mg/g)、异补骨脂苷(1.683mg/g～1.923mg/g)、异槲皮苷(1.575mg/g～2.300mg/g)、荷叶碱(1.113mg/g～1.637mg/g)，约占总含量的85％；其次是紫云英苷、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸a、大黄酸含量低于1mg/g，约占总量的15％；番泻苷b、番泻苷a、丹酚酸c在10批次样品中均未检测到，可能是由于制剂制备过程中不稳定所致。

表1010批次荷丹片中各指标成分的含量测定结果(n＝2，mg/g)

注：“–”表示低于检测限。

批次1-10分别对应批号：20171006、20171102、20171105、20171107、20171109、20171112、20171201、20180101、20180103、20180105

本研究内容建立了荷丹片中21个指标成分的测定方法，系统的方法学研究表明该方法适合于荷丹片中指标成分的检测，并应用于荷丹片10批次的含量测定研究及稳定性研究中。稳定性影响因素研究发现补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-o-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷等糖苷类化合物和丹酚酸b、丹酚酸a等酚酸类化合物含量在高温条件下明显降低，补骨脂素、异补骨脂素、紫草酸含量明显升高的现象。

实施例4、荷丹片中多种有效成分的含量测定色谱条件的优化

系统开展荷丹片多种成分含量测定的色谱条件优化研究，优选了色谱柱、流动相、柱温、检测波长。

色谱柱的选择：通过对agilentzorbaxsb-c18(4.6×100mm,1.8μm)、watersuplcbehc18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱测得的色谱图进行分析，发现选择watersuplcbehc18时荷丹片各化合物分离更优。

流动相的选择：通过比较乙腈–0.1％甲酸水溶液与甲醇–0.1％甲酸水溶液作系统，采用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相时分离效果更好，明显优于甲醇-0.1％甲酸水溶液系统。

柱温的选择：通过比较不同柱温(35、40、45℃)对荷丹片化学成分色谱分离的影响，柱温为40℃时各色谱峰的分离度较好。

检测波长的选择：采用pad检测器对荷丹片样品进行210-400nm全波长扫描，考虑到不同化合物的最大吸收波长差异较大，分别选择各化合物的最大吸收波长作为检测波长，以定时切换波长的方法同时测定各化合物，避免了以单波长分析时出现化合物灵敏度低的情况。