一种银杏叶提取物或其制剂中木脂素类和黄酮醇苷类化合物的检测方法与流程

本发明涉及银杏叶提取物的检测技术领域，尤其涉及一种银杏叶提取物或其制剂中木脂素类和黄酮醇苷类化合物的检测方法。

背景技术：

银杏叶提取物是从银杏叶中提取的有效物质，含有银杏总黄酮，银杏内酯等物质，有扩张血管，保护血管内皮组织、调节血脂、保护低密度脂蛋白、抑制paf(血小板激活因子)，抑制血栓形成、清除自由基等作用。其中发挥清除自由基的作用的成分为木脂素类化合物；发挥扩张血管、保护血管内皮组织以及调节血脂等作用的主要成分是黄酮醇苷类化合物，因此银杏叶提取物或其制剂中木脂素类化合物和黄酮醇苷类化合物的含量直接影响其药效的发挥。

但银杏叶提取物中的两种木脂素类化合物落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷经紫外全波长扫描后，发现两者在uv277nm处呈最大吸收，而该波长下黄酮醇苷类化合物(黄酮醇苷类化合物为urolignoside和大波斯菊苷)也有较强的吸收，因此，无法通过普通高效液相色谱检测上述木脂素类化合物和黄酮醇苷类化合物的含量。

技术实现要素：

针对现有高效液相色谱检测方法无法同时定量检测出银杏叶提取物或其制剂中木脂素类化合物(落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷)和黄酮醇苷类化合物(urolignoside和大波斯菊苷)的含量的问题，本发明提供一种银杏叶提取物或其制剂中木脂素类和黄酮醇苷类化合物的检测方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种银杏叶提取物或其制剂中木脂素类和黄酮醇苷类化合物的检测方法，所述木脂素类化合物为落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷，所述黄酮醇苷类化合物为urolignoside和大波斯菊苷，所述检测方法为uplc-ms法，其中所述uplc的检测条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.08-0.12vt％甲酸水溶液，流动相a与流动相b的体积比为10-35:90-60；

柱温：35-40℃；

流速：0.1-0.5ml/min；

洗脱方式：等度洗脱；

所述ms的检测检测模式为esi负离子模式。

其中urolignoside的结构式为如下：

相对于现有技术，本发明提供的银杏叶提取物或其制剂中木脂素类和黄酮醇苷类化合物的检测方法，采用uplc-ms联用的方法，通过选择上述uplc色谱条件以及ms的检测的负离子模式，可实现对成分复杂的银杏叶提取物或其制剂(如舒血宁注射液)中的紫外吸收波长相同的落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷两种木脂素类化合物以及urolignoside和大波斯菊苷两种黄酮醇苷类化合物的同时定量检测，简化了检验过程，节约了分析时间，且检测的精密度和准确度高、重现性和稳定性好，可用于银杏叶提取物或其制剂的质量控制及综合评价，为提高和控制银杏叶提取物或其制剂的质量提供了可靠保障。

优选的，所述流动相b为0.1vt％甲酸水溶液。

优选的，所述流动相a与流动相b的体积比为10:90。

上述优选的流动相比例，能够更好地分离杂质，利于有落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、urolignoside、松脂醇二葡萄糖苷和大波斯菊苷的检出，可有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。

优选的，所述柱温为40℃，所述流速为0.1ml/min。

优选的，所述检测方法中的进样体积为0.2-1.5μl。

上述优选的色谱条件有利于进一步提高对落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、urolignoside、松脂醇二葡萄糖苷和大波斯菊苷检测的灵敏度。

优选的，所述检测方法中的对照品溶液和供试品溶液的稀释溶剂为甲醇。

优选的，所述检测方法中的对照品溶液中待检测成分的质量浓度为供试品溶液中的13-20倍。

优选的，所述检测方法中的供试品溶液中银杏叶提取物的浓度为0.3-0.4mg/ml。

附图说明

图1是本发明实施例1中进行质谱条件考察的eic色谱图；其中，a为正离子模式[m+h]+，b为负离子模式[m-h]-，c为正离子模式[m+na]+，d为负离子模式[m+cooh]-；

图2是本发明实施例1中uplc-ms法测定舒血宁注射液的色谱图，其中。a空白甲醇，b和c舒血宁注射液，d混合对照品溶液；峰1：落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷，峰2：松脂醇二葡萄糖苷，峰3：urolignoside，峰4：大波斯菊苷。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

材料与方法

仪器：watersxevogx-xs四级杆串联飞行时间质谱

试剂：乙腈、甲醇(色谱纯)，纯化水，其它试剂均为分析纯；落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷对照品

样品：银杏叶提取物、舒血宁注射液

溶液的配制：

对照品溶液的制备：

精密称取落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷12.16mg于50ml容量瓶、松脂醇二葡萄糖苷10.90mg于50ml容量瓶、urolignoside9.20mg于50ml容量瓶、大波斯菊苷10.26mg于50ml容量瓶，甲醇溶解并定容，作为对照品母液。精密量取2ml落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、2ml松脂醇二葡萄糖苷、5mlurolignoside和1ml大波斯菊苷对照品母液至同一25ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，作为混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：

精密量取180mg银杏叶提取物于50ml容量瓶，甲醇溶解并定容，再精密量取1ml上述溶液至10ml容量瓶，甲醇定容，作为银杏叶提取物供试品溶液。

精密量取1ml舒血宁注射液10ml容量瓶，甲醇定容，作为舒血宁注射液供试品溶液。

质谱条件的考察：

通过提取舒血宁注射液中各待测成分的精确分子量，发现松脂醇二葡萄糖苷相对其它木脂素相应最低，因此，以松脂醇二葡萄糖苷为考察对象，考察质谱条件，通过比较了正、负离子模式下松脂醇二葡萄糖苷提取离子流(eic)色谱图，如图1所示，松脂醇二葡萄糖苷在负离子模式下相应好，其母离子的加和物[m+cooh]峰(m/z＝727.2449)明显高于[m-h]-分子离子峰(m/z＝681.2395)，因此，可同时提取样品和对照品中松脂醇二葡萄糖苷的精确分子量m/z＝727.2449(误差范围0.02da)，计算各自eic色谱图的峰面积以达到定量的目的。

检测方法：

通过uplc-ms法测定舒血宁注射液中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的含量，检测条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，2.1mm×100mm，1.6μm；流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.1vt％甲酸水溶液，流动相a与流动相b的体积比为10:90；柱温：40℃；流速：0.1ml/min；洗脱方式：等度洗脱；进样体积为1μl；所述ms的检测检测模式为esi负离子模式，得到的色谱图如图2所示，落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的检测峰之间以及与其它杂峰之间具有较好的分离度。

实施例2

方法学考察及结果

线性关系：将混合对照品溶液分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍与40倍，精密吸取混合对照品溶液及上述稀释后的溶液各1μl注入液相色谱仪，提取各待测成分的精确分子量，记录峰面积。

其中，落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷线性关系考察结果如表1所示；

表1落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷线性关系考察

根据上表，以进样量(ug)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷的回归方程为：

y＝23574.7465x+35594.1644，r2＝0.9997(n＝6)。表明对照品中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷在0.486ug/ml-19.456ug/ml范围内呈良好的线性关系。

松脂醇二葡萄糖苷线性关系考察结果如表2所示；

表2松脂醇二葡萄糖苷线性关系考察

根据上表，以进样量(ug)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到松脂醇二葡萄糖苷的回归方程为：y＝19588.7904x+1355.5158，r²＝0.9996(n＝6)。表明松脂醇二葡萄糖苷在0.436ug-17.440ug/ml范围内呈良好的线性关系。

urolignoside的线性关系考察结果如表3所示；

表3urolignoside线性关系考察

根据上表，以进样量(ug)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到urolignoside的回归方程为：y＝36689.2702x+23247.2047，r²＝0.9996(n＝6)。表明urolignoside在0.920ug-36.800ug/ml范围内呈良好的线性关系。结果见表3。

大波斯菊苷的线性关系考察结果如表4所示；

表4大波斯菊苷线性关系考察

根据上表，以进样量(ug)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到大波斯菊苷的回归方程为：y＝72588.2689x+8307.9403，r²＝0.9998(n＝6)。表明大波斯菊苷在0.205ug-8.208ug/ml范围内呈良好的线性关系。

精密度：将稀释10倍的混合对照品溶液连续进样6次，每次进样1ul，提取各待测成分的精确分子量并测定峰面积，结果如表5所示。

表5精密度考察

分析得到落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的rsd值均小于1.1％，说明该检测方法具有较高的精密度。

重复性：取批号为17080111的舒血宁注射液6份，分别按舒血宁注射液供试品溶液制备方法制得6个样品，每个样品进样1ul，提取各待测成分的精确分子量，测定峰面积，测定结果如表6-9所示。

表6落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷重复性试验结果

表7松脂醇二葡萄糖苷重复性试验结果

表8urolignoside重复性试验结果

表9大波斯菊苷重复性试验结果

分析得到落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的rsd值均小于3％，说明该检测方法具有较高的重现性。

稳定性：取舒血宁注射液(批号17080111)按供试品溶液制备方法制得样品，分别考察将样品放置0、1.5、3、6、12和24小时后待测成分的峰面积，考察结果如表10所示。

表10稳定性试验结果

分析得到落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的rsd值均小于3％，说明该检测方法具有较高的稳定性。

加样回收率：由重复性实验结果可知，批次为17080111的舒血宁供试品溶液中各待测成分的浓度分别为：落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷10.191ug/ml、松脂醇二葡萄糖苷10.423ug/ml、urolignoside27.722ug/ml、大波斯菊苷4.203ug/ml；

因此，精密量取17080111的舒血宁注射液2.5ml至50ml容量瓶，平行9份。其中3份分别加入2ml混合对照品母液，甲醇定容，作为中浓度的供试品溶液；3份分别加入1ml混合对照品母液，甲醇定容，作为低浓度的供试品溶液；3份分别加入3ml混合对照品母液，甲醇定容，作为高浓度的供试品溶液。上述9份供试品溶液每份进样1ul，提取各待测成分的精确分子量，测定各待测成分的峰面积，测定结果如表11-14所示。

表11落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷加样回收率试验结果

表12松脂醇二葡萄糖苷加样回收率试验结果

表13urolignoside加样回收率试验结果

表14大波斯菊苷加样回收率试验结果

分析得到落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的rsd值均小于2.55％，说明该检测方法具有较高的加样回收率。

实施例3

用实施例1中的uplc-ms法检测银杏叶提取物中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的含量。

取10批银杏叶提取物，每批2份，按照实施例1中银杏叶提取物供试品溶液的制备方法制备成待测溶液，精密吸取1ul注入色谱仪，提取各待测成分的精确分子量，记录峰面积，计算银杏叶提取物中各待测成分的含量，含量检测结果见表15-18。

表15银杏叶提取物中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷含量测定结果

表16银杏叶提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量测定结果

表17银杏叶提取物中urolignoside含量测定结果

表18银杏叶提取物中大波斯菊苷含量测定结果

实施例4

用实施例1中的uplc-ms法检测舒血宁注射液中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的含量。

取12批舒血宁注射液(规格2ml：a、b、c；规格5ml：d、e、f；规格10ml：g、h、i；规格20ml：j、k、l；)，每批2份，按照实施例1中舒血宁注射液供试品溶液制备成待测供试品溶液，精密吸取1ul注入色谱仪，提取各待测成分的精确分子量，记录峰面积，计算样品中各待测成分的含量，含量检测结果见表19-22。

表19舒血宁注射中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷含量测定结果

表20舒血宁注射中松脂醇二葡萄糖苷含量测定结果

表21舒血宁注射中urolignoside含量测定结果

表22舒血宁注射中大波斯菊苷含量测定结果

实施例5

对照品溶液的制备：

精密称取落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷12.16mg于50ml容量瓶、松脂醇二葡萄糖苷10.90mg于50ml容量瓶、urolignoside9.20mg于50ml容量瓶、大波斯菊苷10.26mg于50ml容量瓶，甲醇溶解并定容，作为对照品母液。精密量取2ml落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、2ml松脂醇二葡萄糖苷、5mlurolignoside和1ml大波斯菊苷对照品母液至同一25ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，作为混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：

精密量取1ml舒血宁注射液10ml容量瓶，甲醇定容，作为舒血宁注射液供试品溶液。

检测方法：

通过uplc-ms法测定舒血宁注射液中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的含量，检测条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，2.1mm×100mm，1.6μm；流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.08vt％甲酸水溶液，流动相a与流动相b的体积比为20:80；柱温：35℃；流速：0.2ml/min；洗脱方式：等度洗脱；进样体积为0.2μl；所述ms的检测检测模式为esi负离子模式，得到的色谱图中，落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的检测峰之间以及与其它杂峰之间具有较好的分离度。

实施例6

对照品溶液的制备：

精密称取落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷12.16mg于50ml容量瓶、松脂醇二葡萄糖苷10.90mg于50ml容量瓶、urolignoside9.20mg于50ml容量瓶、大波斯菊苷10.26mg于50ml容量瓶，甲醇溶解并定容，作为对照品母液。精密量取2ml落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、2ml松脂醇二葡萄糖苷、5mlurolignoside和1ml大波斯菊苷对照品母液至同一25ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，作为混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：

精密量取1ml舒血宁注射液10ml容量瓶，甲醇定容，作为舒血宁注射液供试品溶液。

检测方法：

通过uplc-ms法测定舒血宁注射液中落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的含量，检测条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，2.1mm×100mm，1.6μm；流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.12vt％甲酸水溶液，流动相a与流动相b的体积比为35:60；柱温：38℃；流速：0.5ml/min；洗脱方式：等度洗脱；进样体积为1.5μl；所述ms的检测检测模式为esi负离子模式，得到的色谱图中，落叶松脂素-4,4-二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、urolignoside和大波斯菊苷的检测峰之间以及与其它杂峰之间具有较好的分离度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。