本发明涉及一种胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用，特别涉及一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术：
肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)是一种多肽生长因子，具有促进包括肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、造血细胞等多种类型细胞的生长、迁移和形态发生的作用。它还参与多种细胞的增殖、迁移，对各类肿瘤的侵袭转移有着重要的诱导作用。
早在1992年mtakemura就报道了采用酶联免疫的方法测定血清中肝细胞生长因子浓度的方法。shiotag等在1995年报告了采用免疫放射法测定血清中肝细胞生长因子浓度的方法。2005utoh等报道了一种快速半定量的免疫层析法(rapidsemi-quantitativeimmunochromatographic(ic))来测定肝细胞生长因子浓度的方法。2002年刘友华等申请了肝细胞生长因子的测定方法(申请号02112853.7)，该方法主要应用酶联免疫技术测定肝细胞生长因子。2015年天津医科大学张宁等申请了肝癌标志物单链抗体的制备及其应用的专利(申请号：201510759337.5)，在其专利中也采用了酶联免疫技术在制备试剂盒。酶联免疫检测法的原理是：将肝细胞生长因子(hgf)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的肝细胞生长因子(hgf)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的肝细胞生长因子(hgf)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入hrp标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入tmb底物显色。tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝细胞生长因子(hgf)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(o.d.值)，计算样品浓度。试剂盒组分通常包括：1)酶标板；2)酶标试剂；3)标准品；4)校准品稀释液；5)样品稀释液；6)显色剂(1个或2个)；7)终止液；8)洗涤液或洗涤液浓缩液。操作步骤包括：加样加酶标抗体、孵育、洗涤、加入显色剂、孵育、加终止液、酶标仪测定。计算测定结果。酶联免疫检测法基于的是一种非匀相检测技术，是一种将抗体固定在固相支持物上的方法。其缺点在于：试剂盒组分多，实验步骤多，需要经过加样、孵育、清洗、再孵育、再清洗、显色等多个步骤，操作复杂，不能实现自动化检测，容易出现操作误差。此外，检测时间长，适用于批量样本的检测，适合科研使用，不能满足临床要求的简单易行的要求。
胶乳免疫比浊法由于具有检测方法简单方便，线性范围宽，稳定性好，同时可在全自动生化仪上实现大量样品检测等优点，已经越来越多的被应用于临床检测项目。胶乳免疫比浊法是通过采用物理吸附或共价键合的方式将抗体或抗原偶联到纳米微球的表面，形成微球-抗体(抗原)复合物。此复合物与样品中的抗原(抗体)，通过抗体抗原反应，形成微球-抗体-抗原聚集颗粒，随着免疫反应的不断发生，聚集的颗粒不断增大，从而导致溶液在一定波长的吸光值发生显著的变化，通过测定免疫反应前后吸光度值的变化可以计算出样品中抗原(抗体)的浓度，从而达到检测和诊断疾病的目的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用。该试剂盒可在全自动生化仪上使用，可实现全自动检测，且只需10分钟即可出结果，线性范围宽，灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒，所述的试剂盒中含有反应试剂r1、反应试剂r2以及校准品和质控品；
其中，所述的反应试剂r1中含有：缓冲剂50-150mmol/l，电解质100-200mmol/l，促凝剂0.5-2％w/w，稳定剂0.05-0.5％w/w，表面活性剂0.05-0.2％w/w，防腐剂0.05-0.5％w/w，ph7.0-8.5；
其中，所述的反应试剂r2中含有结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被的聚苯乙烯微球。
其中，优选的，所述的缓冲剂选自tricine(n-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐)、tes(n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、mops(3-(n-吗非啉)乙磺酸)、pipes(哌嗪-n，n'-二(2-乙磺酸))、bis-trispropane(双[三(羟甲基)氨基丙烷]/1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)、bes(n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙璜酸)、mops(3-(n-吗啡啉)乙磺酸)、hepes(n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸)、tes(n-3-(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、dipso(3-[n-n-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、tapso(n-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸)、tris(三羟甲基氨基甲烷)、heppso(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸)、popso(哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸)、epps(4-羟乙基哌嗪丙磺酸)、tea(三乙醇胺)、tricine(n-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、磷酸盐中的至少一种；
其中，优选的，所述的电解质选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠中的至少一种；
其中，优选的，所述的促凝剂选自peg6000，peg8000，聚凝胺中的至少一种；
其中，优选的，所述的稳定剂选自牛血清白蛋白(bsa)、兔血清、牛血清、甘露醇、海藻糖中的至少一种；
其中，优选的，所述的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲通100、聚氧乙基月桂醚中的至少一种；
其中，优选的，所述的防腐剂选自叠氮钠、2-氯乙酰胺、脱氢乙酸钠、尼泊尔金甲酯钠、对羟基甘氨酸钠、4-羟基苯甲酸乙酯、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷(bnd)、2-羟基吡啶-n-氧化物(oxy-pyrion)、咪唑烷基脲、甲基异噻唑啉酮(mit)中的至少一种。
其中，优选的，所述的重组蛋白a蛋白g融合蛋白为以基因工程方法获得的蛋白a和蛋白g的融合蛋白，包含金黄色葡萄球菌蛋白a的5个fc结合域和链球菌蛋白g的2个fc结合域；所述的聚苯乙烯微球的直径为50nm-300nm，所述重组蛋白a蛋白g融合蛋白与所述聚苯乙烯微球的质量比为100mg～600mg：1g。
其中，优选的，所述的重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被的聚苯乙烯微球通过以下方法制备得到：将1ml10％的中等密度羧基微球用ph5.0的100mmol/lmes缓冲液清洗两次后，用10ml上述缓冲液重悬并加入20mgedc，缓慢搅拌15-20分钟；用ph8.2的100mmol/l硼砂缓冲液离心清洗2次后，用ph8.2的100mmol/l硼砂缓冲液重悬微球并温和搅拌；在悬浮液中加入5ml含有5-7mg/ml重组蛋白a蛋白g融合蛋白的20mmol/lph7.4磷酸缓冲液中，在18-30℃条件下缓慢搅拌2-4小时；用硼砂缓冲液清洗一次后，加入ph8.2的含1g/lbsa的10ml100mmol/l的甘氨酸缓冲液重悬，缓慢搅拌放置10分钟；用该缓冲液清洗两次，重悬在含0.1g/lbsa以及1g/lnan3的10ml50mmol/lph7.4的磷酸盐缓冲液中制成微球浓度为10mg/ml的重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被的聚苯乙烯微球悬浮液，储存在2-8℃备用。
其中，优选的，所述的结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被的聚苯乙烯微球是通过以下方法制备得到：
用等体积的抗体结合缓冲液(20mmol/lpbs，0.5mol/lnacl，ph7.0)清洗重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被的聚苯乙烯微球2次后弃上清，将鼠抗人肝细胞生长因子抗体以80-200μg/ml的浓度溶解在与微球等体积的抗体结合缓冲液中，将抗体溶液加入清洗好的微球中，将微球重悬，而后在10-30℃下温和搅拌30-60分钟；离心弃上清，用等体积的1mol/lnacl溶液清洗微球两次；将微球重悬在储存液中；
其中，优选的，所述的抗体结合缓冲液为含有0.5mol/lnacl，ph7.0的20mmol/lpbs；储存液中的微球浓度为10mg/ml，所述的储存缓冲液中含有：100mm缓冲剂、0.01％w/wbsa、0.05％w/w表面活性剂、10mmedta、0.1％w/wnan3，ph8.5。
其中，优选的，所述的缓冲剂选自tris、硼砂、碳酸盐、heppso、popso、epps、tea、tricine、bicine、taps中的至少一种；所述的表面活性剂选自tween20、thestit、tritonx-100、brij35中的至少一种。
其中，优选的，所述的校准品为分别依次含有0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0ng/ml肝细胞生长因子的系列标准品，除了肝细胞生长因子外，所述的系列标准品中还含有：缓冲剂50-150mmol/l、氯化钠100-200mm、赋形剂5-10％w/w，防腐剂0.05-0.1％w/w，ph7.0-8.0；配制后进行冷冻干燥；
其中，优选的，所述的质控品中含有：缓冲剂50-150mmol/l,氯化钠100-200mm，赋形剂5-10％w/w，防腐剂0.05-0.1％w/w，肝细胞生长因子0.4ng/ml或1.5ng/ml，ph7.0-8.0，配制后进行冷冻干燥；
其中，优选的，所述的缓冲剂选自tricine(n-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐)、tes(n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、mops(3-(n-吗非啉)乙磺酸)、pipes(哌嗪-n，n'-二(2-乙磺酸))、bis-trispropane(双[三(羟甲基)氨基丙烷]/1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)、bes(n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙璜酸)、mops(3-(n-吗啡啉)乙磺酸)、hepes(n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸)、tes(n-3-(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、dipso(3-[n-n-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、tapso(n-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸)、tris(三羟甲基氨基甲烷)、heppso(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸)、popso(哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸)、epps(4-羟乙基哌嗪丙磺酸)、tea(三乙醇胺)、tricine(n-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、磷酸盐中的至少一种；
其中，优选的，所述的赋形剂选自bsa、甘露醇、海藻糖、乳糖中的至少一种；
其中，优选的，所述的防腐剂选自叠氮钠、2-羟基吡啶-n-氧化物(oxy-pyrion)、咪唑烷基脲、甲基异噻唑啉酮(mit)中的至少一种。
其中，优选的，所述的校准品和质控品按照0.5ml/只分装到西林瓶中，分装好的校准品或质控品在-20℃预冻5小时以上；按照隔板温度-40℃3小时—-20℃5小时—0℃8小时—5℃4小时—10℃4小时—20℃2小时设置冻干程序，启动冷冻干燥机，待冷冻干燥机隔板温度降至-50℃时，将样品放入，启动冻干程序。
进一步的，本发明还提出了所述的胶乳免疫比浊检测试剂盒在制备检测人肝细胞生长因子试剂中的应用。
本发明试剂盒的检测原理是：当待测样本与试剂混合后，样本中的hgf特异地与抗hgf抗体反应形成不溶性的复合物，引起浊度增加。用570-700nm的吸光度测量浊度。通过测量一系列校准品即可获得hgf的浓度和吸光度的校准曲线。将样本与抗体反应产生的吸光度与校准曲线比较即可测定出样本中hgf的浓度。
操作步骤是：将试剂盒放入全自动生化仪试剂仓，校准品、质控品和样本放在全自动生化仪的样本仓，在全自动生化仪上设定分析参数，启动仪器，仪器自动测定并计算出结果。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明建立了一套采用准匀相测定技术为基础的试剂盒及其制备方法，该试剂盒可以在全自动生化仪上使用，只需10分钟即可出结果。现有技术为手工操作，需要30-45分钟方可出结果。相较于现有方法操作简便，快捷；
2、本发明采用以基因工程方法获得包含金黄色葡萄球菌蛋白a的5个fc结合域和链球菌蛋白g的2个fc结合域的重组蛋白a蛋白g融合蛋白，结合能力较单一的蛋白a和蛋白g的融合蛋白有很大提高，而且有更强的fc段结合能力。与多数哺乳动物的iggfc段结合(包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)。目前常用重组蛋白a蛋白g融合蛋白琼脂糖纯化树脂用于抗体的纯化。本发明将重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被到50nm-300nm的聚苯乙烯羧基微球表面制备蛋白a/g微球，并将该微球用于hgf胶乳免疫比浊诊断试剂中胶乳抗体的制备，能够显著提高免疫反应的效率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1试剂盒的制备及分析性能评估
1、试剂盒的制备
(1)反应试剂r1的制备
材料：tris(分析纯)、氯化钠(分析纯)、牛血清白蛋白(bsa)(高纯)、peg6000(纯度＞98％)、吐温20(试剂级)、叠氮钠(纯度＞99％)。
在500ml的烧杯中加入400ml左右的体外诊断试剂纯化水，加入tris6.05g，搅拌实质完全溶解。用hcl调节ph为7.4-7.5。加入氯化钠4.5g，peg60000.5g，bsa0.5g，叠氮钠1g，吐温200.5g搅拌使之完全溶解，精确调节ph为7.40±0.10。用体外诊断试剂纯化水定容至510g。用0.22μm的水性滤膜过滤。
(2)反应试剂r2的制备
a.重组蛋白a蛋白g融合蛋白(重组蛋白a/g)包被的聚苯乙烯微球的制备
材料：重组蛋白a/g(包含金黄色葡萄球菌蛋白a的5个fc结合域和链球菌蛋白g的2个fc结合域，纯度＞95％，购买自上海普欣生物技术有限公司)，中等密度羧基微球(10％，150nmnm)；mes缓冲液(ph5.0,100mmol/l)；硼砂缓冲液(ph8.2，100mmol/l)；edac(纯度＞98％)；甘氨酸缓冲液(ph8.2,100mmol/l)
制备过程：
将1ml10％的中等密度羧基微球用ph5.0的mes缓冲液(100mmol/l)清洗两次后，用10ml上述缓冲液重悬并加入20mgedc，缓慢搅拌15-20分钟。用ph8.2硼砂缓冲液(100mmol/l)离心清洗2次后，用5ml该缓冲液重悬微球并温和搅拌。在悬浮液中加入5ml含有重组蛋白a/g的磷酸缓冲液(重组蛋白a/g5-7mg/ml、磷酸根20mmol/lph7.4)。在18-30℃条件下缓慢搅拌2-4小时。用硼砂缓冲液清洗一次后，加入含1g/lbsa的10ml100mmol/l的甘氨酸缓冲液(ph8.2)重悬，缓慢搅拌放置10分钟。用该缓冲液清洗两次，重悬在10ml磷酸盐缓冲液中(pbs50mmol/l，bsa0.1g/l，nan31g/l，ph7.4)制成微球浓度为10mg/ml的蛋白a/g微球悬浮液。储存在2-8℃备用。
b结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被的聚苯乙烯微球的制备
材料：a步骤制备的蛋白a/g微球。鼠抗人肝细胞生长因子单克隆抗体。抗体结合缓冲液(20mmpbs，0.5mnacl，ph7.0)。结合清洗液(1mnacl)。储存缓冲液(100mmtrisph8.2，0.01％w/wbsa、0.05％w/wtween20、10mmedta、0.1％w/wnan3、牛血清10ml/l。)
方法：
用20ml的抗体结合缓冲液(20mmpbs，0.5mnacl，ph7.0)清洗20mla步骤制备的蛋白a/g微球(10mg/ml)2次后弃上清。将待结合肝细胞生长因子抗体以大约100μg/ml的浓度溶解在与蛋白a/g微球20ml的抗体结合缓冲液中。将抗体溶液加入清洗好的蛋白a/g微球中，将微球重悬，而后在室温下(10-30℃)温和搅拌40分钟。离心弃上清，用20ml的1mnacl溶液清洗微球两次。将30ml储存缓冲液重悬后，充分搅拌，用0.45μm的水系滤膜过滤，即为结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白a蛋白g融合蛋白包被的聚苯乙烯微球。
(3)肝细胞生长因子校准品和质控品的制备
a.缓冲液配制：在500ml烧杯中，加入400ml体外诊断试剂纯化水，以此投入tris3.025g、氯化钠4.38g、bsa0.5g、甘露醇25g、叠氮钠1g，待完全溶解后调节ph至7.4±0.1，最后定容至500ml，使各物质终浓度为tris50mmol/l,氯化钠150mmol/l，bsa1g/l，甘露醇50g/l，叠氮钠2g/l。配制好的溶液用0.22μm的水性滤膜过滤。
b.校准品与质控品的配制
100ml烧杯中加入80ml缓冲液，加入肝细胞生长因子，最后定容至100ml，使其终浓度为4ng/ml。搅拌30-40分钟后，用0.22μm的水性滤膜过滤。
用缓冲液稀释4ng/ml的高值校准品，使其终浓度为0.25，0.5、1、2、4、0.4、1.5ng/ml，具体稀释方法如表1：
表1
c.校准品与质控品的冷冻干燥
校准品和质控品按照0.5ml/只分装到西林瓶中。分装好的校准品或质控品在-20℃预冻5小时以上。按照隔板温度-40℃3小时—-20℃5小时—0℃8小时—5℃4小时—10℃4小时—20℃2小时设置冻干程序。启动冷冻干燥机，待冷冻干燥机隔板温度降至-50℃时，将样品放入，启动冻干程序。
2、试剂盒分析性能的评估
a.检测条件与检测参数
检测仪器au640全自动生化仪
检测参数：主波长：600nm
r1试剂：150ul
r2试剂：50ul
s样本：20ul
反应方向：升反应
方法：end
读点:a1150-180sa2400-500s
b.检测线性
用人血清稀释浓度为4ng/ml的高值样本，混合成稀释比例为0、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2、3/4、1共8个不同梯度的样品(xi)，分别测试试剂(盒)。每个稀释浓度的样本测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程y＝0.1411+3.8724x。计算线性回归的相关系数(r)为0.9991。
c.灵敏度(最低检测限)
以4％的人血清白蛋白溶液为空白样本，用本发明制备的试剂盒测定20次，结果其吸光度变化均值为1.0981，标准差sd为0.0312。以空白吸光度变化均值加上两倍的标准差为1.1606。用空白样本稀释低值标准液，制备出浓度为0.0625、0.125、0.25ng/ml的三个样本，用本发明制备的试剂盒测定20次，其吸光度变化均值为1.1009(1.0567-1.1522)、1.1733(1.1231-1.2376)、1.2545(1.1901-1.3059)，表明试剂盒的灵敏度可达到0.25ng/ml。
d.重复性
连续测定本发明制备的2个质控各20次，计算均值、标准差和变异系数(cv)。测定浓度为0.4ng/ml的质控结果为测量均值0.3985，标准差0.0300，变异系数7.52％。测定浓度为1.5ng/ml的质控，测量均值为1.4980，标准差,0.0613，变异系数4.09％。
e.人血清参考范围
检测120例正常人血清样本，结果均值为0.24，标准差为0.54。以均值加减两倍sd作为健康人的参考范围，结合考虑到本法的灵敏度为0.25ng/ml，故确定健康人的参考范围为小于0.34ng/ml。