一种通过外周血循环肿瘤细胞检测肾细胞癌患者E-Cadherin基因突变的方法与流程

本发明涉及一种检测e-cadherin基因突变的新方法，尤其是通过外周血检测无法获取组织标本的晚期或复发肾细胞癌患者e-cadherin基因突变的方法。
背景技术：
：肾细胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率约占全身恶性肿瘤的2-3％，近几十年其发病呈上升趋势。根治性手术是治疗肾细胞癌的有效手段，但约有20％～30％的肾细胞癌患者就诊时已出现远处转移。即使经历肾细胞癌根治手术，仍有20％～40％的患者会出现复发、转移。既往研究认为，上皮间质转化（emt）在肾细胞癌复发转移过程中发挥了重要作用，因此监测emt可用于肾细胞癌的疗效判断及预后评估。循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell，ctc）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因ctc检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。e-钙粘蛋白(e—cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，e-cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此e-cadherin检测被作为鉴定肾细胞癌emt发生的主要手段之一。大量研究证实，不同的肿瘤的进展都与emt的发生有关，且都伴随着e-cadherin表达的改变。而目前临床实践中，肾细胞癌患者e-cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。技术实现要素：为了克服晚期或复发肾细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者e-cadherin状态的不足，本发明提供了一种肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin基因突变非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发非肾细胞癌患者外周血中的ctc，进一步运用免疫组化技术检测ctc的e-cadherin表达情况。本发明采用的技术方案如下：一种检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin基因突变的试剂盒，包括稀释液45ml、脱色液1ml、染色液a0.5ml、染色液b1ml、e-cadherin（小鼠）一抗100μl、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体100μl、0.1%tritonx-100100μl、0.3%h2o2100μl、6×pbs缓冲液60ml，所述pbs缓冲液的ph值为7.2。进一步地，所述稀释液是由1mmol/ledta+0.1%bsa+0.1%海藻糖+0.2%月桂醇聚氧乙烯醚组成。进一步地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。进一步地，所述染色液a为dab染色液；所述染色液b为苏木素染色液。一种利用上述试剂盒非诊断目的检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin基因突变的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肾细胞癌患者外周血中的ctc：采集无法获取组织标本的晚期或复发肾细胞癌患外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血ctc：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液a液0.5ml加入到滤器中，染色3min，pbs缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液b液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在ctc；（5）运用免疫组化技术检测ctc的e-cadherin表达情况。进一步地，所述检测ctc的e-cadherin表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有ctc的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去ctc染色液；（2）滴加100μl0.1%tritonx-100，室温孵育15min，di水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%h2o2，室温孵育10min，pbs洗2min×3次；（4）滴加100μle-cadherin（小鼠）一抗，室温孵育2h或4℃过夜，pbs洗2min×3次；（5）滴加100μl连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体，18～26℃温度下孵育20min，pbs洗2min×3次；（6）滴加100μldab显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉dab显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的ctc采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入0.5ml试剂a，振荡均匀后，加入1ml试剂b，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本发明所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。本发明的有益效果是：（1）本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肾细胞癌患者e-cadherin表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。（2）本发明提供的方法，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。附图说明图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；图4为肾细胞癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明阐述如下。本发明所使用的试剂盒具体规格如表1所示：e-cadherin（小鼠）一抗100μl、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体100μl表1组分含量6×pbs缓冲液60ml稀释液45ml脱色液1ml染色液a0.5ml染色液b1mle-cadherin（小鼠）一抗100μl连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体100μl0.1%tritonx-100100μl0.3%h2o2100μl运用此技术方法分离获取并鉴定10例肾细胞癌患者（同时检测10例正常人样本做阴性对照）外周血循环肿瘤细胞的实施例。实施例1一、利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肾细胞癌患者外周血中的ctc，确定ctc是否存在：自肘正中静脉采集空腹8-12小时的空腹血5ml，用45ml稀释液(成分：1mmol/ledta+0.1%bsa+0.1%海藻糖+0.2%月桂醇聚氧乙烯醚)稀释外周血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀释后的血样10分钟；在固定的间期，组装膜过滤装置：如附图1、图2、图3所示，该过滤装置由滤器3、滤膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成；用10mlpbs润湿滤器3，然后将固定好的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤，ctc被截留在滤膜7上；肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞（包括红细胞、白细胞）直径一般小于8微米，因此当含有ctc的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔10能够被滤过，而ctc因直径大于滤孔10被截留在滤膜7上。过滤结束后，从过滤装置中取下滤器3，打开并移走滤器上口6，将将循环肿瘤细胞染色液a液0.5ml加入到滤器中，染色3min，pbs缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入b液，1ml，染色2min，纯水1ml,pbs缓冲液将滤器3冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜7，细胞面朝上，放置在载玻片上；将滤膜干燥后在显微镜下观察,确定是否存在ctc。通过观察，10例健康志愿者均未查到ctc；除1例晚期肾细胞癌患者和2例复发肾细胞癌患者未检测到ctc外，其余7例均检测到ctc（表1），本次检测阳性率为70%，值得注意的是，当稀释液不添加0.1%海藻糖或者不添加0.2%月桂醇聚氧乙烯醚时，单一的采用0.3%海藻糖或者0.3%月桂醇聚氧乙烯醚，制备的血样稳定性差，部分血样还会形成分层，血液细胞容易发生聚集和粘连，影响最终的检测效果。表1实施例ctc检测结果二、运用免疫组化技术检测ctc的e-cadherin表达情况：将载玻片上载有ctc的滤膜7从载玻片上取下，置于95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1混匀的脱色液中浸泡4-6小时，脱去ctc染色液；滴加100μl0.1%tritonx-100，室温孵育15min，di水洗2min×3次；滴加100μl0.3%h2o2，室温孵育10min，pbs洗2min×3次；滴加100μle-cadherin（小鼠）一抗，室温孵育2h（或4℃过夜），pbs洗2min×3次；滴加100μl连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体，室温（18~26℃）孵育20min，pbs洗2min×3次；滴加100μldab显色液，室温（18~26℃）孵育并随时在显微镜下观察显色情况（一般为3~10min，时间不能超过10min）；显色完成后，弃掉dab显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，将沉淀物晾干，中性树脂封固；光学显微镜下镜检，细胞病理学专家阅片，根据细胞膜和细胞浆着色程度判定e-cadherin表达情况。图4为肾细胞癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图，其中ctc细胞细胞核异型性，核质比大于0.8，细胞直径（长端）大于15μm，核深染（由于癌细胞染色质增多，颗粒变粗，核深染）其细胞核较大，细胞核形状不规则；高核质比。所检测的循环肿瘤细胞应用免疫组化证实e-cadherin的表达并与肾细胞癌大体标本e-cadherin结果对比，观察其差异，主要针对大体标本e-cadherin表达阴性而循环肿瘤细胞表达阳性的患者，指导肾细胞癌的靶向治疗，为肾细胞癌靶向治疗提供新的思路。当前第1页12