一种改性透明质酸烷氧基取代度的检测方法与流程

[0001]
本申请涉及透明质酸的检测领域，且更为具体地涉及一种改性透明质酸烷氧基取代度的检测方法。


背景技术：

[0002]
透明质酸(hyaluronic acid，简称ha)又名玻璃酸，是由(1-3)-2-乙酸氨基-2-脱氧-d-葡萄糖(1-4)-d-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖。1934年由meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。透明质酸由于拥有独特的分子结构和理化性质，因此在机体内显示出多种重要的生理功能，由于ha具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品、医药和临床治疗等行业领域。
[0003]
透明质酸因为本来就存在皮肤中，作为天然的保湿因子有很强的保湿效果，透明质酸在化妆品、医药等领域的应用也越来越广泛，比如作为眼用制剂的媒介广泛应用于眼用制剂中，也是皮下填充注射的热门材料，但是天然透明质酸在组织中吸收迅速，停留时间短，不适用于对材料硬度、机械强度和稳定性有一定要求的场合，因此需要对透明质酸进行修饰改性，或者与其它材料复合，拓宽其应用领域。为了使改性透明质酸适用于各领域，需要精确调节改性透明质酸的修饰度，与之相对应的，需要对改性透明质酸的修饰程度有稳定可靠的检测手段，为后续的生产研发试验提供技术支持。
[0004]
改性透明质酸烷氧基取代度检测目前尚没有统一的标准，改性纤维素烷氧基取代度的检测方法并不适用于改性透明质酸，易出现爆瓶、杂质峰干扰检测等问题。
[0005]
中国专利cn105784891a中公开了一种羟乙基纤维素的检测方法，公开的方法中使用的反应容器为顶空瓶，在150℃条件下，邻二甲苯汽化(沸点144.4℃)，顶空瓶与瓶塞结合处极易出现爆塞现象，使有机蒸汽暴露在加热箱的150℃高温环境下，存在极大的安全隐患；而且其检测对象为纤维素，并没有涉及透明质酸类物质的检测，未涉及干扰杂质如乙醇等对透明质酸羟乙氧基取代度检测的影响，因透明质酸原料生产过程中会引入乙醇残留，因为乙醇上含有醇羟基，会直接与氢碘酸中的卤素离子发生亲核取代反应，生成碘乙烷，对最终的试验结果产生影响，且在150℃条件下，按照公开的方法进行改性透明质酸羟乙氧基取代度试验后，色谱图中存在杂峰，且与目标峰大部分重叠，严重影响试验精确度。


技术实现要素：

[0006]
为了解决上述问题，本发明人在日常分析工作中，通过大量的试验，建立了一种适合于改性透明质酸烷氧基取代度检测的方法。
[0007]
本发明采用如下技术方案。
[0008]
本发明提供一种改性透明质酸烷氧基取代度的检测方法，包括以下步骤：
[0009]
第一步：提取反应体系中的烷氧基改性透明质酸样品，得到烷氧基改性透明质酸纯品；
[0010]
第二步：将烷氧基改性透明质酸纯品进行烷氧基反应，得到用于检测烷氧基取代度的供试品溶液；
[0011]
第三步：利用气相色谱法检测供试品溶液，通过反应产物的量测定改性透明质酸烷氧基取代度。
[0012]
作为本发明的一种优选技术方案：所述改性透明质酸为含有烷氧基官能团的透明质酸，取代度为0.1％～40％；所述烷氧基官能团为甲氧基，乙氧基，羟丙氧基、羟乙氧基，优选为羟乙氧基。
[0013]
作为本发明的一种优选技术方案：所述第一步反应体系中的烷氧基改性透明质酸的提取方法为醇沉法或冻干法。
[0014]
作为本发明的一种优选技术方案：所述第二步中烷氧基改性透明质酸的烷氧基反应，步骤为：选择带橡胶环的玻璃密封瓶，取烷氧基改性透明质酸纯品精密称定，置于玻璃密封瓶中，加入己二酸，然后加入分析纯邻二甲苯与氢碘酸溶液，用带橡胶环的聚四氟乙烯瓶塞密封，精密称定，于烘箱中加热，冷却，反应完全后，取反应瓶中上清液作为供试品溶液。
[0015]
作为本发明的一种优选技术方案：所述玻璃密封瓶的耐受压力应不小于50psi，玻璃密封瓶精密称定，减重小于反应瓶中内容物的0.1％，且无渗漏；烘箱温度为75～100℃，反应时间为18～30h。
[0016]
作为本发明的一种优选技术方案：所述邻二甲苯的加入量为2ml，己二酸加入量为0.20～0.47mg/mg供试品，优选为0.24～0.36mg/mg供试品，所述氢碘酸溶液氢碘酸含量为57％，氢碘酸溶液的加入量为0.005～0.016ml/mg供试品，优选为0.0075～0.01ml/mg供试品。
[0017]
作为本发明的一种优选技术方案：所述第三步中气相色谱法所使用的色谱柱固定相为6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷，优选的色谱柱为db-624。
[0018]
作为本发明的一种优选技术方案：所述色谱柱的初始柱温为40℃，维持两分钟，以2.5℃/min的升温速率升至60℃，维持两分钟，以50℃/min的升温速率升至210℃，维持两分钟；载气流速1.5～3ml/min；进样口温度150℃；检测器fid温度250℃。
[0019]
作为本发明的一种优选技术方案：所述通过气相色谱法检测供试品溶液，再将检测出来的数值通过外标法计算得到烷氧基取代度。
[0020]
作为本发明的一种优选技术方案：通过外标法计算烷氧基取代度时，以10μl～30μl碘代烷作为对照品溶液，所述对照品溶液还包括与权利要求4反应体系等量的己二酸、分析纯邻二甲苯与氢碘酸溶液，密封、摇匀取上清液。
[0021]
有益效果
[0022]
本发明具有如下有益效果：
[0023]
1、本发明在特定的温度范围内，改性透明质酸在特定含量的氢碘酸和己二酸存在下发生烷氧基反应，生成碘代烷，用于检测烷氧基取代度，反应过程可控，不会出现爆瓶等现象，用气相色谱对反应产物进行取代度检测时，结果稳定性高，排除了杂峰对检测结果的干扰。建立了一种适用于改性透明质酸烷氧基取代度检测的方法。
[0024]
2、本发明所述的改性透明质酸烷氧基取代度的检测迅速、结果稳定性高，能够用于快速检测改性透明质酸烷氧基取代度。
[0025]
3、从图1图2中我们可以看出，对照组出峰时间在12.02min左右，无拖尾，色谱条件良好，无空白干扰。图3为实施例1色谱图，图4为对比例1色谱图，目标峰出峰时间与对照品符合，可以确定12.02min左右的目标峰为碘乙烷目标峰，图3目标峰处无干扰，图4目标峰处出现难以分离的杂质峰，无法准确读出峰面积，进而影响试验准确度。
[0026]
综上所述，采用本发明的反应条件可以大大增强试验的安全性和准确性，杜绝了爆瓶等危险因素对实验安全带来的风险，同时减少反应杂质的生成，大大提高试验准确性。
附图说明
[0027]
图1为实施例1中的对照品色谱图。
[0028]
图2为实施例1中的空白色谱图。
[0029]
图3为实施例1中的样品色谱图。
[0030]
图4为对比例1中的样品色谱图。
具体实施方式
[0031]
外标法是仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内标法相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。
[0032]
改性透明质酸在制作过程中需要将其从反应溶液中分离，由于透明质酸类物质易溶于水不溶于乙醇，因此常用的透明质酸分离方法为乙醇沉降法，沉降后的改性透明质酸中会含有大量的乙醇残留，因为乙醇上含有醇羟基，会直接与氢碘酸中的卤素离子发生亲核取代反应，生成碘乙烷，对最终的试验结果产生影响。冻干法会排除乙醇残留的影响，但冻干机设备昂贵，维持低温冷阱能耗大，相较于可以将乙醇循环利用的醇沉法，生产成本大大增加，因此市场上绝大部分透明质酸原料均为醇沉法生产。要排除乙醇残留对试验结果的影响，需要先检测样品中的乙醇残留，最后基于色谱检测结果使用外标法确定所述待测样品中的羟乙氧基含量，结合乙醇残留结果，计算样品中的羟乙氧基取代度。
[0033]
实施例
[0034]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
[0035]
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]
实施例1
[0037]
以下将对本发明做以详细说明。
[0038]
一种改性透明质酸羟乙氧基取代度的检测方法，包括以下步骤：
[0039]
第一步：醇沉法或冻干法提取反应体系中的羟乙氧基改性透明质酸样品，得到羟乙氧基改性透明质酸纯品；
[0040]
第二步：羟乙氧基改性透明质酸纯品进行羟乙氧基反应：选择带橡胶环的玻璃密封瓶，玻璃密封瓶的耐受压力应不小于50psi，取供试品65mg精密称定，置于玻璃密封瓶中，加入己二酸，己二酸加入量为20mg，然后加入分析纯邻二甲苯2ml与氢碘酸溶液57％氢碘酸溶液0.5ml，用带橡胶环的聚四氟乙烯瓶塞密封，精密称定，于烘箱中加热，烘箱温度为80
℃，反应时间为24h，从烘箱中取出冷却，反应完全后，精密称定，若减重小于反应瓶中内容物的0.1％，且无渗漏，可直接取反应瓶中上清液作为供试品溶液；另取玻璃密封瓶，加入己二酸20mg，加入分析纯邻二甲苯2ml与57％氢碘酸溶液0.5ml，加入碘乙烷对照10μl，用带橡胶环的聚四氟乙烯瓶塞密封，充分摇匀后取反应瓶中上清液作为对照品溶液；另取玻璃密封瓶，加入己二酸20mg，加入分析纯邻二甲苯2ml与57％氢碘酸溶液0.5ml，用带橡胶环的聚四氟乙烯瓶塞密封，充分摇匀后取反应瓶中上清液作为空白溶液；
[0041]
第三步：使用气相色谱检测所得到的供试品溶液、对照品溶液和空白溶液，最后基于色谱检测结果使用外标法确定所述待测样品中的羟乙氧基含量，结合乙醇残留结果，计算样品中的羟乙氧基取代度，其中，采用的气相色谱条件为：气相色谱法的色谱柱为db-624，色谱柱的初始柱温为40℃，维持两分钟，以2.5℃/min的升温速率升至60℃，维持两分钟，以50℃/min的升温速率升至210℃，维持两分钟；载气流速1.5ml/min；进样口温度150℃；检测器fid温度250℃；
[0042]
改性透明质酸为接枝有羟乙氧基官能团的透明质酸，取代度为0.1％-40％；
[0043]
本发明的检测方法采用外标法，直接经气相色谱检测。
[0044]
1.仪器试剂
[0045]
安捷伦1260气相色谱仪、分析天平：梅特勒托利多al104、带橡胶环的聚四氟乙烯瓶塞和玻璃耐压瓶。
[0046]
超纯水、邻二甲苯(分析纯)、氢碘酸(57％)、碘乙烷(99％)、己二酸(分析纯)。
[0047]
2.色谱条件
[0048]
色谱柱:db-624；
[0049]
进样量：1μl；
[0050]
流动相：n2；
[0051]
流速:1.5ml/min；
[0052]
柱温：初温为40℃，保持2分钟，以2.5℃/min的速率升温至60℃，保持2分钟，以50℃/min的速率升温至210℃，保持2分钟；
[0053]
检测器fid：250℃；
[0054]
进样口加热器：150℃；
[0055]
3.溶液配制
[0056]
选择带橡胶环的玻璃密封瓶，取供试品65mg，精密称定，置于玻璃密封瓶中，加入己二酸20mg，加入分析纯邻二甲苯2ml与57％氢碘酸溶液0.5ml，用带橡胶环的聚四氟乙烯瓶塞密封，精密称定，于80℃烘箱中加热24h，冷却，精密称定，若减重小于反应瓶中内容物的0.1％，且无渗漏，可直接取反应瓶中上清液作为供试品溶液；另取玻璃密封瓶，加入己二酸20mg，加入分析纯邻二甲苯2ml与57％氢碘酸溶液0.5ml，根据供试品中所含羟乙氧基的含量，加入碘乙烷对照10μl，用带橡胶环的聚四氟乙烯瓶塞密封，充分摇匀后取反应瓶中上清液作为对照品溶液。
[0057]
4.测定
[0058]
使用自动进样器，分别取空白溶液、对照品溶液、待测溶液1μl进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算待测样品溶液中碘乙烷含量。
[0059]
按照国标yy/t 0308-2015进行样品中乙醇残留检测。
[0060]
5.计算
[0061]
按以下公式计算待测样品中的待测样品羟乙氧基取代度(w％)：
[0062][0063]
v——加入对照品溶液体积(μl)
[0064]
z——对照品碘乙烷含量(％)
[0065]
ρ——对照品碘乙烷相对密度
[0066]
n——碘乙烷对照品摩尔数(mmol)
[0067]
m——碘乙烷相对摩尔质量
[0068][0069]
ni——待测样品中碘乙烷摩尔数(mmol)
[0070]
ai——待测样品中碘乙烷的峰面积
[0071]
n——碘乙烷对照品摩尔数(mmol)
[0072]
as——对照品中碘乙烷的峰面积
[0073][0074]
w——待测样品羟乙氧基取代度(％)
[0075]
ni——待测样品中碘乙烷摩尔数(mmol)
[0076]
nc——待测样品中乙醇摩尔数(mmol)
[0077]
m——待测样品相对摩尔质量
[0078]
m——待测样品质量(mg)
[0079]
6.结果
[0080]
将待测样品中改性透明质酸羟乙氧基取代度量检测结果如表1所示。
[0081]
表1实施例1的待测样品的色谱分析结果
[0082][0083]
色谱图如图1～3所示。
[0084]
从图1图2中我们可以看出，对照组出峰时间在12.02min左右，无拖尾，色谱条件良好，无空白干扰。
[0085]
图3为实施例1色谱图，目标峰出峰时间与对照品符合，可以确定12.02min左右的目标峰为碘乙烷目标峰，图3目标峰处无干扰，说明采用本发明的反应条件可以大大增强试验的安全性和准确性，杜绝了爆瓶等危险因素对实验安全带来的风险，同时减少反应杂质的生成，大大提高试验准确性。
[0086]
实施例2
[0087]
延长实施例1中的样品烘干时间，使样品中乙醇进一步挥发，其它条件与实施例1相同，详情见表2
[0088]
表2实施例2的待测样品的色谱分析结果
[0089]
[0090][0091]
实施例3
[0092]
将实施例1中的己二酸添加量改为23mg，其它条件与实施例1相同，详情见表3。
[0093]
表3实施例3的待测样品的色谱分析结果
[0094][0095]
实施例4
[0096]
将实施例1中的己二酸加入量改为16mg，其它条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量，详情见表4。
[0097]
表4实施例4的待测样品的色谱分析结果
[0098]
[0099][0100]
实施例5
[0101]
将实施例1中的加热温度改为100℃，其它条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量，详情见表5。
[0102]
表5实施例5的待测样品的色谱分析结果
[0103][0104]
实施例6
[0105]
将实施例1中的氢碘酸加入量为0.65ml，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中碘乙烷的含量，详情见表6。
[0106]
表6实施例6的待测样品的色谱分析结果
[0107]
[0108][0109]
实施例7
[0110]
将实施例1中的己二酸加入量为13mg，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中碘乙烷的含量，详情见表7。
[0111]
表7实施例7的待测样品的色谱分析结果
[0112][0113]
实施例8
[0114]
将实施例1中的己二酸加入量为30mg，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中碘乙烷的含量，详情见表8。
[0115]
表8实施例8的待测样品的色谱分析结果
[0116][0117]
实施例9
[0118]
将实施例1中的氢碘酸加入量改为0.33ml，其它条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量，详情见表9。
[0119]
表9实施例9的待测样品的色谱分析结果
[0120][0121]
实施例10
[0122]
将实施例1中的氢碘酸加入量为1.0ml，其它条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量，详情见表10。
[0123]
表10实施例10的待测样品的色谱分析结果
[0124][0125]
实施例11
[0126]
将实施例1中的加热温度改为75℃，其它条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量，详情见表11。
[0127]
表11实施例11的待测样品的色谱分析结果
[0128][0129]
实施例12
[0130]
将实施例1中的加热时间改为18h，其它条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量，详情见表12。
[0131]
表12实施例12的待测样品的色谱分析结果
[0132][0133]
实施例13
[0134]
将实施例1中的加热时间改为30h，其它条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量，详情见表13。
[0135]
表13实施例13的待测样品的色谱分析结果
[0136][0137]
实施例14
[0138]
将实施例1中的载气流速改为3ml/min，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中碘乙烷的含量，详情见表14。
[0139]
表14实施例14的待测样品的色谱分析结果
[0140][0141]
实施例15
[0142]
将实施例1中的对照品供试品改为甲氧基改性透明质酸，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中碘甲烷的含量，详情见表15。
[0143]
表15实施例15的待测样品的色谱分析结果
[0144][0145]
实施例16
[0146]
将实施例1中的对照品供试品改为乙氧基改性透明质酸，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中碘乙烷的含量，详情见表16。
[0147]
表16实施例16的待测样品的色谱分析结果
[0148][0149]
实施例17
[0150]
将实施例1中的对照品供试品改为羟丙氧基改性透明质酸，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中2-碘丙烷的含量，详情见表17。
[0151]
表17实施例17的待测样品的色谱分析结果
[0152][0153]
对比例1
[0154]
将实施例1加热温度改为150℃，此条件下碘乙烷与杂质的色谱峰未能完全分离，无法准确读出峰面积，进而影响试验准确度，因此检出结果偏差较大，如图4所示。
[0155]
表18对比例1的待测样品中的色谱分析结果
[0156][0157]
对比例2
[0158]
将实施例1加热温度改为60℃，其他条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量。
[0159]
表19对比例2的待测样品中的色谱分析结果
[0160][0161]
对比例3
[0162]
将实施例1中的己二酸加入量改为80mg，氢碘酸加入量改为2ml，其他条件与实施例1相同，测定碘乙烷的含量。
[0163]
表20对比例3的待测样品中的色谱分析结果
[0164][0165]
对比例4
[0166]
将实施例1中的载气流速改为0.8ml/min，其他条件与实施例1相同，测定碘乙烷的含量。降低载气流速后，碘乙烷的出峰时间大幅靠后，峰型变宽，检测效率降低。
[0167]
表21对比例4的待测样品中的色谱分析结果
[0168][0169]
对比例5
[0170]
反应瓶中内容物的减重不小于0.1％，其他条件与实施例1相同，测定碘乙烷的含量。此条件下生成的碘乙烷挥发，因此检验结果数值偏小。
[0171]
表22对比例5的待测样品中的色谱分析结果
[0172]
[0173][0174]
对比例6
[0175]
将实施例1氢碘酸加入量改为0.2ml，其他条件与实施例1相同，测定样品中碘乙烷的含量。
[0176]
表23对比例6的待测样品中的色谱分析结果
[0177][0178]
对比例7
[0179]
将实施例1的反应容器改为10ml顶空瓶，采用配套橡胶塞压盖密封。由于此顶空瓶密封能力有限，出现瓶塞胀裂现象，内容物泄露严重，未完成检测。
[0180]
表24实施例和对比例的运行效果比较
[0181]
[0182][0183]
如表24所示，对比例1、2由于反应温度过高或过低，检测结果偏差较大，对比例3由于加入了过量了氢碘酸和己二酸，发生副反应导致色谱图中出现严重干扰主峰的杂峰，影响试验准确度。对比例4降低载气流速后，碘乙烷的出峰时间大幅靠后，峰型变宽，检测效率降低。对比例5由于密封问题导致瓶内反应物散失过多，对比例7没有采用耐压容器，导致容器爆瓶，容易引发安全事故。对比例6由于反应物加入量过少，导致反应不完全。综上所述，本发明通过控制反应温度、反应时间和反应物量等条件，选择合适的反应容器，摸索出最适合于改性透明质酸烷氧基取代度的检测条件。
[0184]
本发明的实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其他的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。