的溶解性，和e)它抑制药物的降解，以便保持它们的生物或化学活性。
[0196]在组织液化过程之前或期间，LPM也可包含药物。在供选的实施方案中，可将施加能量和排除药物的LPM用于将组织液化，随后，可将适当载体(如贴片)中的药物用于要液化的组织的部位上。
[0197]试剂盒
[0198]本公开还包括用于实施本方法的试剂盒。本主题试剂盒可包括例如使关注的组织液化的整个能量施加装置和液化促进剂，用于进行试验以检测和分析(定性或定量)通过本文公开的方法产生的液化组织样品中存在或不存在组织分析物的试剂。试剂盒的不同组分可存在于单独的容器中，或者某些相容的组分可根据需要在单一容器中预先组合。
[0199]除了上述组分外，试剂盒一般还包括用试剂盒的组分实施所述方法的说明书。用于实施主题方法的说明书一般记录在适合的记录介质上。例如，说明书可印刷于基材(如纸或塑料等)上。因此，说明书可作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组分的容器的标签上(即，与包装或分包装结合)等。在其它实施方案中，说明书作为电子储存数据文件存在，存在于适合的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、软盘等)上。在其它实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但是提供用于从远程源(例如，通过互联网)得到说明书的方法。此实施方案的实例为包括网址的试剂盒，在网址上可看到说明书和/或从网址可下载说明书。与说明书一样，得到说明书的这种方法记录在适合的介质上。
实施例
[0200]提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完全公开和说明，而不旨在限制发明人认为是其发明的范围，它们也不旨在表示以下实验为进行的全部或唯一实验。虽然已努力保证关于所用数字(例如量、温度等)的精确度，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为。C，压力在或接近大气压。
[0201]虽然已参考其具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的真实精神和范围下，可进行各种变化并可用等价体代替。另外，可作出很多修改以使特定情况、材料、物质组成、方法、方法步骤或步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改旨在属于权利要求的范围内。
[0202]实施例1
[0203]通过基于磨料能量的装置皮肤取样
[0204]参考图7a至7e，这些图描述用于皮肤组织取样的基于磨料能量的组织液化装置。装置从以下三个组件组装-751 (含有电动机704和电导率组件705和706的装置壳701的组合件)；752 (LPM筒708、收集容器707和针709的一次性组合件)；和753 (LPM壳712、磨料垫711和轴710的一次性组合件)(图7a)。将组装的装置对着皮肤713上预先鉴别的关注区域放置，使得磨料垫711面对皮肤713 (图7b)。将位于装置顶部的滑动活塞702推向皮肤，这将针709推入LPM筒708，破坏其无菌密封，并将LPM转移到壳712中。滑动活塞702也通过电池组703对电动机704供电，将轴710和磨料垫711设置为对着皮肤组织713旋转运动。由于皮肤组织液化，组织组分溶于壳712中所含的LPM中。皮肤组织713的电导率也同时用固定到轴710的滑动接触705作为测量电极和参比电极706测量。一旦通过阈值电导率测定达到安全能量暴露限度，电动机704停止。进一步将滑动活塞702推向皮肤，使得针709刺破预抽真空的样品容器707，将样品从壳712吸到它里面(图7d)。将装置从皮肤移走并拆开。将装置组件752进一步拆开，并处理样品容器707用于分析物的检测。
[0205]实施例2
[0206]通过基于微针的装置皮肤取样
[0207]参考图8a至8d，这些图描述用于皮肤组织取样的基于微针的组织液化装置。将装置对着皮肤807上预先鉴别的关注区域放置，使得具有微针的贴片805面对皮肤807 (图8a)。将位于装置顶部的滑动活塞801推向皮肤807，以便挤压浸透LPM的海绵804，并将LPM释放到壳803中(图8b)。因此，贴片805中的微针和在皮肤界面的壳803用LPM填充。为了开始液化过程，将滑动活塞801进一步推入皮肤组织807中，导致微针805插入皮肤组织807(图Sc)。由于皮肤组织液化，组织组分溶于壳803中所含的LPM中。在完成皮肤液化时，将预抽真空的样品容器802推向皮肤组织807，使得针806刺破样品容器802，导致样品从壳803吸到它里面(图8d)。将装置从皮肤移走并拆开。收回样品容器802用于分析物分析，并将其余装置组件处理掉。
[0208]实施例3
[0209]用于捕获组织分析物的储存器壳
[0210]参考图9 (图片a-d)，图9描述用于从液化组织样品捕获组织分析物的储存器壳的设计。储存器壳(901)旨在与本文描述的能量施加装置一起使用，作为容器收集液化组织样品。该壳用捕获基质(902)涂覆，捕获基质(902)选择性结合样品中存在的组织分析物(903)。在充分培育组织样品后，将样品弃去，同时使分析物(903)保留在壳中。分析物由壳中的洗脱缓冲剂洗脱，用于随后捕获分析物作为单独的样品(904)。或者，可将壳整合在分析工具中用于分析结合的分析物(903)。
[0211]实施例4
[0212]用于增强的组织溶解和蛋白功能性保持的表面活性剂制剂
[0213]鉴别独特的表面活性剂制剂组成根据本文公开的定义的液化促进介质(LPM)。用属于以下四个不同种类的19种表面活性剂产生153种二元表面活性剂制剂库:(i)阴离子表面活性剂(月桂基硫酸钠(SLS)、十二烷醇聚醚硫酸钠(SLA)、十三烷基磷酸钠(TDP)、去氧胆酸钠(SDC)、癸酰基肌氨酸钠(NDS)、月桂酰基肌氨酸钠(NLS)、棕榈酰基肌氨酸钠(NPS)) ；(ii)阳离子表面活性剂(辛基三甲基氯化铵(OTAB)、十二烷基三甲基氯化铵(DDTAB)、十四烷基三甲基氯化铵(TTAB))两性离子表面活性剂(3_[(3_胆酰胺基丙基)二甲基铵基]1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(癸基二甲基铵基)丙磺酸盐(DPS)、3-(十二烷基二甲基铵基)丙磺酸盐(DDPS)) ；(iv)非离子表面活性剂(聚乙二醇十二烷基醚(B30)、聚氧乙烯23-月桂基醚(B35)、聚氧乙烯10-鲸蜡基醚(B56)、聚氧乙烯2-硬脂基醚(B72)、聚乙二醇油基醚(B93)、壬基苯酚聚乙二醇醚(NP9))。只有来自这些种类的少数表面活性剂(例如非离子表面活性剂)已传统用于提取功能组织蛋白质组。另外，这些表面活性剂高度受限于它们有效溶解组织成分的能力。因此，在所有表面活性剂类型中，组织成分的提取潜力和生物活性保持在很大程度上被认为是互相冲突的性质。通过使非离子表面活性剂与以前对其高溶解能力描述的其它类型表面活性剂(阴离子、阳离子和两性离子表面活性齐U)组合，我们显示了同时具有优良的溶解以及不变性能力的新的表面活性剂制剂家族的发现。
[0214]首先筛选表面活性剂，以鉴别保持提取物蛋白生物活性的不变性的表面活性剂制齐U，随后对制剂溶解组织蛋白的能力分级。图1Oa显示153种表面活性剂制剂保持模型蛋白-1gE抗体的特异性功能性的效力。具体地讲，试验IgE抗体与卵白蛋白的结合能力。此图中的X轴表示对各个二元制剂唯一的制剂序号。y轴表示％ IgE生物活性保持，其定义为，和表面活性剂在纯溶剂(磷酸盐缓冲盐水，PBS)中时的IgE结合活性相比，在表面活性剂制剂中的分数IgE结合活性。制剂跨越宽范围的变性可能性。令人惊讶的是，在与较温和的非离子表面活性剂组合时，增大数量的变性表面活性剂得到IgE功能性保持的高度协同增加。发现在所有二元表面活性剂制剂中平均的不变性潜力显著高于它们的单一表面活性剂制剂成分(P < 0.006 ;双尾异方差的斯氏(student’ s) t_试验)；进一步证明独特的协同相互作用。
[0215]对于显示高生物活性保持(> 90% )的表面活性剂制剂，进一步就它们与简短超声处理结合提取组织蛋白的能力进行筛选。用猪皮肤作为这些研究的模型组织。虽然大部分制剂显示接近0.1mg蛋白/cm2皮肤组织的提取能力，但只有一对制剂达到超过0.3mg/cm2的蛋白提取(图10b)。
[0216]从表面活性剂库筛选的主要候选者总的来说得到异常不变性但比文献中报道的一些最广泛使用的提取表面活性剂更有效地溶解组织的制剂。图1Oc将主要表面活性剂制剂-0.5% (w/v)DPS-B30与1% (w/v) SDS对于皮肤取样进行了比较。尽管其提取能力适中(0.16±0.07mg/cm2)，但SDS高度变性，这导致低功能蛋白回收率(保持的分数生物活性和总提取蛋白的乘积)。相反，0.5% (w/v)DPS-B30制剂不仅提取更多的皮肤蛋白(0.48±0.12mg/cm2)，而且保持蛋白活性，总计相对于SDS比预期功能蛋白回收提高超过100倍。类似地，相对于一般使用的不变性表面活性剂I % (w/v) Triton X-1OO和PBS，实现了大于10倍的蛋白回收。
[0217]实施例5:
[0218]应力下的生物活性保持
[0219]我们显示独特的表面活性剂制剂或LPM(由实施例1中所述的方法鉴别)另外在应力下保护多种分析物。我们具体显示通过使用独特的表面活性剂制剂，机械能(如超声暴露(一般已知的对生物分子的变性剂))的变性作用可被抵消。
[0220]在单独的实验中，将球状蛋白(IgE)和两种代表性酶(乳酸脱氢酶(LDH)和β -半乳糖苷酶(β-Gal))溶于0.5% (w/v)DPS-B30表面活性剂制剂，并超声处理，以测定随时间的蛋白生物活性保持。溶于盐水(PBS)的蛋白作为比较性对照制备。对溶于PBS的IgE观察到功能性的渐进式急剧减小，然而令人惊讶的是，0.5% (w/v)DPS-B30制剂延长对IgE蛋白针对超声变性应力的保护(图1la)。不考虑超声处理，溶于SDS的IgE显示完全变性状态。对在0.5% (w/v)DPS-B30制剂中制备的LDH和β-Gal的酶活性延长保持观察到类似趋势(图1lb)。在PBS中的蛋白制品导致生物活性显著损失(P < 0.006 ;双尾异方差的斯氏t-试验)，在3分钟超声处理后总计分数生物活性为16.7% (IgE),70.8% (LDH)和68.7% ( β -Gal)。
[0221]实施例6
[0222]组织取样和分子诊断
[0223]本实施例证明在LPM(0.5% (w/v)DPS-B30的盐水溶液)存在下超声暴露从组织取样多种功能疾病生物标志的能力。
[0224]本实施例证明从对蛋过敏的小鼠的皮肤取样过敏特异性IgE抗体。从CharlesRiver Labs (Wilmington,MA)购买6至8周大小的雌性BALB/CJ小鼠，并在无病原体的条件下供养。通过皮内(epicutaneous)暴露规程诱导小鼠的过敏反应。在用氧中的1.25_4%异氟烧麻醉后，削刮小鼠背上的皮肤，然后条剥(tape strip) 10次(Scotch Magic带，3MHealth Care7St PauI,MN)，以引入标准化皮肤伤害。将用100 μ L 0.1% OVA浸透的纱布贴片(IcmXlcm)放在背部皮肤上，并用基于透气弹性布的粘合带固定。保持贴片固定I个星期。整个实验包括总共3次I周的暴露，在各个暴露周之间有2周间隔。利用最小量的基于氰基丙烯酸酯的粘合剂，通过使定制的凸缘室(皮肤暴露面积1.33cm2)粘合到经削刮的皮肤区域，进行取样。该室用1.8ml 0.5% (w/v)DPS-B30表面活性剂制剂填充，并以50%占空系数，2.4W/cm2施加20kHz超声5分钟。得到经超声处理或未经处理的湿疹皮肤部位的皮肤活组织检查，并制备皮肤均浆样品作为正对照。图12a显示与健康小鼠比较，超声辅助取样从过敏小鼠皮肤成功取样显著更大量的过敏特异性IgE抗体。如预料的，在来自过敏和健康小鼠皮肤的样品中IgG抗体的量见不到差异。
[0225]本实施例也证明从小鼠皮肤取样胆固醇。利用以上段落中所述的类似程序，利用超声程序收集皮肤样品。从未经处理的皮肤收集的活组织检查制备皮肤均浆作为正对照。皮肤胆固醇为诊断心血管疾病[I]的重要生物标志。图12b显示超声辅助取样从皮肤成功取样胆固醇，取样的量可与皮肤均浆中存在的胆固醇相比。
[0226]最后，证明从猪皮肤取样细菌基因组。通过不同的微生物组(包括细菌、真菌和病毒)[2-5]拓殖组织，特别是皮肤和粘膜。精确诊断细菌感染导致适当的患者处理，为预测提供信息，并允许使用窄谱抗生素[6-8]。因此，确定的微生物检测对诊断是十分重要的，该诊断用于感染的治疗和与微生物感染有关的疾病爆发的溯源。然而，精确得到代表皮肤上的微生物的样品是个主要挑战[2]。最实际的收集方法是拭取，因为它简单、快速、非侵害[3，9]。然而，拭取有几个限制，包括不良的微生物回收，并且缺乏标准化规程，这显示它不精确代表皮肤上的微生物，或者不提供定量数据。超声辅助取样可有效解决这些限制。特别地，通过用在盐水(PBS)中浸透的棉球拭取，并通过在单独的实验中用0.5% (w/v)DPM-Brij30作为LPM的超声辅助取样，可对切除的猪皮肤取样。通过标准苯酚-氯仿提取方法，从各个样品纯化细菌基因组。简而言之，首先在溶液中在37°C培育样品30分钟[9]，所述溶液由 20mM Tris (pH 8.0) (BP154-1, Fisher Scientific)、2mM EDTA (BP 120-500，Fisher Scientific)>1.2% Triton X-1OO (BP 151-100, Fisher Scientific)和 20mg/ml溶菌酶(62970-1G-F，Sigma-Aldrich)组成。随后，在溶液中在37°C培育该样品3小时，所述溶液由 0.lmg/ml 蛋白酶 K(P2308_25MG, Sigma-Aldrich) >0.5% (w/v)月桂基硫酸钠(S529,Fisher Scientific)和 10mM 氯化钠(BP358-1,Fisher Scientific)组成。然后，用相等体积的苯酹(P4557, Sigma-Aldrich)提取基因组DNA,随后用苯酹/氯仿/异戍醇25: 24: I (P2069，Sigma-Aldrich)提取。通过用乙醇培育并离心20分钟使DNA沉淀。用70%乙醇洗涤DNA颗粒两次，使之干燥，并重新悬浮于80 μ I的tris缓冲剂中。由各种方法取样的细菌量通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)测定各个样品中保存的16S细菌基因的存在而评价。图12c显示，与常规棉拭取程序相比，超声辅助取样从皮肤取样至少7倍高的细菌基因组量。
[0227]实施例7
[0228]与基于核酸的试验相容的LPM的缓冲剂设计
[0229]为了保证液化组织样品与随后分析的相容性，必须小心选择LPM的组分。试验数种LPM组分与基于核酸的分析技术的相容性。具体地讲，通过测量试验使不同LPM中加入的质粒DNA放大的能力，评价LPM组分与qPCR(最普通的基于基因的试验)的相容性。
[0230]将突光素酶质粒(E 1741,Promega Corp.)的一千万个拷贝穿刺(spike)于10 μ I不同的溶液中:(i)水，(ii)水中的 0.91% (w/v)氯化钠(BP358-1, Fisher Scientific),
(iii)PBS(P4417, Sigma-Aldrich), (iv)1mM Tris-HCl, ρΗ7.9(BP154-1，FisherScientific), (v)0.075M磷酸钠缓冲剂，pH 7.9，衍生自磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠(S9638-25G, S7907-100G，Sigma-Aldrich),和(vi)水中的 0.5mM EDTA(BP120-500，Fisher Scientific)。将溶液与10 μ I PCR反应缓冲剂混合。荧光素酶放大引物对于正向引物为 5' -GCC TGA AGT CTC TGA TTA AGT-3'，对于反向引物为 5' -ACA CCT GCG TCGAAG-3'，产生96bp的扩增子[10]。放大反应在20 μ I溶液中进行，所述溶液含有1.5mMMgCl2、0.2μΜ(各自)弓丨物和PCR缓冲剂中的0.2mM dNTP以及0.025单位/ μ I Taq聚合酶(10966-034，Invitrogen)和 1: 45，000 的 SYBR-绿(S-7563，Invitrogen)。将质粒 DNA的等分试样稀释于水中以产生标准曲线。使用光学级96孔板在iCycler PCR机(B1-RadLaboratories, Inc.)上进行分析。反应的热循环设置如下:最初在95°C变性3分钟，随后40个以下循环:在95°C变性30秒，在60°C退火30秒和在72°C伸长30秒，所有都随后在72°C最后延长10分钟。对各个样品进行三次重复。对于各个缓冲剂，通过与对照(在水中的质粒DNA)比较而计算相容性。
[0231]图13显示，与对照比较，氯化钠、PBS和磷酸钠缓冲剂作为定量PCR试验的检测缓冲剂不相容。然而，用tris-HCl或EDTA作为缓冲剂增大分析试验的检测能力。
[0232]实施例8
[0233]LPM与基于核酸的试验的相容性
[0234]试验多种LPM(实施例1中公开)与现存的基于核酸的试验的相容性。具体地讲，将质粒DNA与不同的LPM混合，并评价qPCR放大DNA的能力。通过将不同浓度的表面活性剂加入1mM Tris-HCl缓冲剂中制备LPM。为了模拟本文中公开的组织液化过程，将各个LPM与0.2mg/ml猪皮肤均浆混合，且每10 μ I LPM穿刺荧光素酶质粒(Ε 1741, PromegaCorp.)的一千万个拷贝。将此溶液与10 μ I PCR反应缓冲剂混合。根据实施例4中所述的规程进行qPCR。将经纯化的质粒DNA稀释于tris-HCl溶液中以产生标准曲线。通过测定由qPCR放大的质粒量，并将它与对照缓冲剂(tris-HCl中的质粒DNA，没有表面活性剂)比较，计算各个LPM的相容性。
[0235]图 14 显示，Triton X-100、Brij 30、DMSO, OTAB, OTAB-Brij 30 和 DPS-Brij 30与定量PCR高度相容，然而，由NLS或NLS-Bri j30组成的LPM不能放大DNA。值得注意的是，DPS-Brij 30作为LPM有效从组织取样生物分子，保持蛋白活性，并与分析方法(包括ELISA、色谱法和qPCR)相容。因此，DPS-Brij 30最合乎需要作为液化促进介质用于分析蛋白、脂类和核酸。已知作为PCR促进剂的Triton X-100和DMSO[II] —致显示有效地产生聚合酶链反应，然而，它们不得到令人满意的组织提取。
[0236]实施例9
[0237]用于从组织取样有生活力且基因完整的微生物的超声参数的鉴别
[0238]本实施例描述从组织有效收集活微生物的超声的非致死条件。通过向组织施加不同形式的能量，可从组织收集微生物，然而，使用高能量对微生物的生活力非常有害。因此，找到用于取样活微生物的非致死能量施加条件十分重要。我们描述用于从皮肤取样有生活力且基因完整的细菌的超声暴露条件。
[0239]在Luria-Bertani (BP1426, Fisher Scientific)中在 37 °C, 250rpm,或者在琼脂板(37 0C )上作为固体培养物，生长E.Coli菌株DHlOa (18290-015，Invitrogen)的细菌培养物。通过离心收获培养物，并使所得颗粒以19个细胞/ml的浓度悬浮于包含1mM Tris-HCl, pH 7.9 的 LPM。E.Coli 细胞用分光光度计(B1photometer, Eppendorf)定量，并将0.25X 1