采用sle法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物饲料的检测领域，特别是一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇 的方法。
【背景技术】
[0002] 样品前处理是分析检测过程的关键环节，是浓缩被测定的痕量组分，提高方法的 灵敏度，及除去对分析系统有干扰的物质的重要手段。萃取是从样品集体中分离出目标化 合物的一项技术，是样品预处理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是应用最广泛的 样品制备方法之一，但是，传统的液液萃取的操作繁琐费时、有机溶剂消耗量大，而且容易 出现乳化现象的缺陷，使得在实际应用中具有一定的局限性。
[0003] 1998年，科学家提出了在传统的液液萃取的基础上，利用一种具有吸附性和较大 的比表面积的惰性多空填料作为介质，建立的一种新型高效样品的制备方法-介质液液萃 取（supported liquid extraction简称SLE)，SLE萃取技术就是选用一种多孔性惰性材 料-煅烧硅藻土作为介质，取代分液漏斗，增大了两相接触时的作用面积，实现高效、快速 的萃取过程。
[0004] 当水溶液样品加样到固定的聚丙烯注射管中的煅烧硅藻土上后，经过一定时间 (一般分为几分钟），水相溶液以一层薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，将有机溶剂 从柱管上端加入，当互不相溶的两相在硅藻土表面接触的同时萃取立即发生，最后萃取液 在重力作用下流出，必要情况下，可以施加较小的压力，而水相保留在介质中。盛接的流出 液直接将溶剂吹干，复溶后，即可用于下一步分析检测。
[0005] 农业部1025号公告-11-2008公开了猪尿中β -受体激动剂多残留检测，其采用 酶解后异丙醇-乙酸乙酯进行萃取，并通过内标法可以得到相关的检测结果，但是在实际 应用中，为了使沙丁胺醇与蛋白质分离，需要采用酶解的方式，然后在采用传统方法萃取后 通过色谱检测，有时无法检出残留项。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简单、检出限低的采用SLE法分离 猪尿中的沙丁胺醇的方法。
[0007] 本发明的技术方案为：一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，包括以下 步骤：
[0008] 步骤1:样品预处理；收集猪尿，首先加入β -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 进行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的Ph范围为 6. 5~7. 0的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合0. 5~1. 5分钟后离心，将经混合处理的溶液在 离心机中以9000~11000转/分钟的速度离心0. 5~1. 5分钟；取离心后的上清液；步骤 2 :将上清液加入到SLE柱后，静置2~4分钟；
[0009] 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇 的洗脱液；
[0010] 其中，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙酸乙酯和乙腈的重 量比为1:0. 8~1. 1。
[0011] 在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，所述的猪尿为1ml，缓冲溶 液为4ml，步骤2中所取的上清液为0. 5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为 0· 5ml 〇
[0012] 在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，每毫升的尿液中加入 β -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12 μ L。
[0013] 在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，所述的三氯乙酸和猪尿的 质量比为1:98~100
[0014] 在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，所述的SLE柱为奥秘山东 科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱。
[0015] 本发明的有益效果如下：
[0016] 采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇，先进行酶解使蛋白质和沙丁胺醇分离，采用 缓冲溶液进行混合，然后通过SLE柱分离出沙丁胺醇，萃取剂为乙酸乙酯和乙腈，本发明的 分离效率好、分离时间短、检出限低有利于后期的测量。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合【具体实施方式】，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对 本发明的任何限制。
[0018] 实施例1
[0019] 步骤1 :收集猪尿1ml，首先加入12 μ Lf3 -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行 酶解，酶解时间为3-4小时，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的Ph 为6. 5的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0. 5ml ;三氯乙酸和猪尿 的质量比为1:99。
[0020] 步骤2 :将上清液加入到SLE柱后，静置3分钟；SLE柱为奥秘山东科技有限公司生 产的介质液液萃取SLE柱。
[0021] 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗 脱液；每次消耗的洗脱剂为〇. 5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙 酸乙酯和乙腈的重量比为1:1。
[0022] 实施例2
[0023] 步骤1、收集猪尿1ml，首先加入12 μ L β -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行 酶解，酶解时间为3-4小时，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的Ph 为7的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0. 5ml ;三氯乙酸和猪尿的 质量比为1:98。
[0024] 步骤2 :将上清液加入到SLE柱后，静置4分钟；SLE柱为奥秘山东科技有限公司生 产的介质液液萃取SLE柱。
[0025] 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗 脱液；每次消耗的洗脱剂为〇. 5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙 酸乙酯和乙腈的重量比为1:1. 1。
[0026] 标准样的制备
[0027] 称取沙丁胺醇标准品（纯度彡99% )0.0 lOOg，置于1000 ml容量瓶中，用重量比为 1:1的乙酸乙酯和乙腈的混合物的溶剂溶解定容，其浓度为10 μ g/ml ;
[0028] 取上述浓度为10 μ g/ml的沙丁胺醇溶液于1000ml容量瓶中，配制成为2 μ g/L、 5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L 的标准样。
[0029] 对比例I
[0030] 与实施例1大体相同，不同的地方在于，步骤3中，洗脱剂为异丙醇与乙酸乙酯的 混合物，其体积比为60:40。
[0031] 分析：
[0032] 检测方法具体为：
[0033] 仪器：LC-2010型高效液相色谱仪（日本岛津）
[0034] 色谱柱：C18 柱，150mm*3. 9mmID
[0035] 柱温：室温
[0036] 流动相：水：乙腈=100:12 (体积比）；
[0037] 检测器：UV检测器；
[0038]检测波长：220nm ;
[0039] 进样量：20 μ L
[0040] 以2 μ g/L、5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L的标准样进行测试，回归方程为Y = 17250X+1. 5, R2= 0· 9993, X为待测物浓度，Y为峰面积。
[0041] 取同一份猪尿1kg，按照实施例1的方法制备10份萃取样品A标号为A1-A10,按 照对比例1的方法制备10份萃取样品B标号为B1-B10。
[0042] 按照上述检测方法进样检测，得到如下的检测结果：
[0043]
【主权项】
1. 一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1 :样品预处理；收集猪尿，首先加入0 _盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进 行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的Ph范围为 6. 5~7. O的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合0. 5~1. 5分钟后离心，将经混合处理的溶液在 离心机中以9000~11000转/分钟的速度离心0. 5~1. 5分钟；取离心后的上清液； 步骤2 :将上清液加入到SLE柱后，静置2~4分钟； 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗 脱液； 其中，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙酸乙酯和乙腈的重量比 为 1:0. 8 ~1. 1〇
2. 根据权利要求1所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，所述 的猪尿为Iml，缓冲溶液为4ml，步骤2中所取的上清液为0. 5ml，所述的步骤3中，每次洗脱 时所用的洗脱剂为〇.5ml。
3. 根据权利要求1所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，每毫 升的尿液中加入0 -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12 y L。
4. 根据权利要求1所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，所述 的三氯乙酸和猪尿的质量比为1:98~100。
5. 根据权利要求1至4任一所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征 在于，所述的SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱。
【专利摘要】本发明公开了一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，包括以下步骤：步骤1：样品预处理；收集猪尿，首先加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的Ph范围为6.5～7.0的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液；步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗脱液。本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简单、检出限低的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法。
【IPC分类】G01N30-14
【公开号】CN104807928
【申请号】CN201510238932
【发明人】陈学松, 赖秀梅, 温志芳, 陈启钊, 郭振旺, 吴岚
【申请人】广西壮族自治区梧州食品药品检验所
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月12日