唐氏综合征图谱模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种获取作为中间结果的唐氏综合征信息，特别是涉及一种唐氏综合 征图谱模型的构建方法。
【背景技术】
[0002] 唐氏综合征（DownSyndrome，DS)，是由常染色体异常引起的遗传病。该病患者往 往具有3条21号染色体，而正常只有两条。该病具有较高的发病率，患者主要特征为严重 的先天性智力低下智力障碍、具有特殊的面容、体格发育迟缓，和特殊面容，并常伴有先天 性心脏病、免疫力低下等80多种疾病。相对于正常人，DS患者罹患白血病的几率也大大增 加，由于患者大多数不能料理自己的生活，而且基本不能劳动，因此给家庭和社会造成沉重 的经济负担。据统计，每例唐氏综合征患儿会给家庭带来大约39. 00万元人民币的经济负 担，而给社会造成的经济负担则高达45. 00万元人民币左右。目前我国大约有60万唐氏综 合征患者。在国外，唐氏综合征的发病数量占所有染色体异常疾病的91. 6%。
[0003] 唐氏综合征是最为常见的染色体数目异常的非整倍体遗传病，出生干预是目前预 防该病的有效措施。目前，干预DS患者的出生的主要方式是进行产前筛查及产前诊断。但 是传统的产前筛查漏检率和假阳性较高。因此，为了提高DS胎儿的检出率，降低侵入式产 前诊断带来的风险性，研宄者们致力于探索通过母血胎儿有核细胞，母血胎儿游离DNA和 母血胎儿游离RNA等途径，建立新的无创伤性产前诊断方法。
[0004] 胎儿有核细胞中的基因组包括了胎儿所有的遗传信息，因此最初的无创产前诊 断主要集中于孕妇循环血中完整胎儿有核细胞的研宄。因胎儿有核红细胞表面具有特异性 标记，不易增殖，且半衰期短，因而被认为是最适合的无创产前诊断的胎儿细胞类型。对母 血胎儿有核红细胞的分析主要包括细胞富集，鉴别和针对性检测（如PCR，FISH等）。但由 于母血中胎儿细胞数量过少，每毫升母血中往往不到1个，制约了这一途径的发展。
[0005] 胎儿游离的DNA片段存在于母体外周的循环血中，由于胎儿游离的DNA在孕妇血 浆中的含量大，大概占孕妇血浆总DNA含量的3%~6%，比胎儿细胞占母血总细胞的比例 要大的多，因此胎儿游离DNA在无创产前诊断中的应用开始备受关注。最早将母体外周循 环血中胎儿游离DNA用于产前诊断唐氏综合征的研宄发现，在怀孕时间基本相近时，孕DS 孕妇血浆中胎儿游离DNA大约为孕正常胎儿孕妇1到2倍。但因为有大量母源游离DNA存 在，相对而言胎儿游离DNA含量较低，因而需采用亚硫酸盐转化或者甲醛等方法富集母体 外周循环血中的胎儿游离DNA，但是这些富集方法存在一定的缺陷，使得胎儿游离DNA的检 测的存在着非常大的困难，其付出的成本与效益之间的比值也还有待于考察。
[0006]胎儿游离RNA的来源与胎儿游离DNA相同，并且是以蛋白-RNA复合物的形式存在 于血浆中，因此稳定性较好。利用胎儿游离RNA进行无创性产前诊断比胎儿游离DNA具有优 势，主要表现在：孕妇血浆中胎儿游离RNA的绝对含量高，分析难度降低；孕妇血浆中mRNA 完全来自胎盘组织，没有了母体游离RNA的干扰。
[0007] 目前，利用母血胎儿游离RNA进行产前筛查唐氏综合征的方法主要基于RNA-SNP 的比例关系。从理论上看，唐氏综合征的3条21号染色体中有2条来源于父亲（母亲），剩 下的1条则来源于母亲（父亲）。21号染色体相关基因的杂合SNP位点上不同的核苷酸在 正常细胞中的比例是1 : 1，但是在唐氏综合征患者中的比例是2 : 1或1 : 2。假设基因 的转录效率是相同的，那么在血浆中mRNA-SNP的比例关系与DNA-SNP的比例是一致的。采 用数字PCR和质谱两种技术对孕妇血浆中PLAC4基因的mRNA-SNP比例关系进行测定，可以 取得96. 5%的临床特异性和90%的临床灵敏度。然而基于质谱和数字PCR技术的母血胎 儿游离RNA检测方法，步骤繁琐、成本较高，因而直到目前都没有得到广泛的应用。
[0008] 综上所述，基于传统产前筛查和产前诊断的缺陷，以及已有无创性产前诊断方法 的不足，使得探索新的无创性唐氏综合征胎儿产前诊断标志物具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0009] 基于此，有必要针对上述问题，提供一种唐氏综合征图谱模型的构建方法。
[0010] 一种唐氏综合征图谱模型的构建方法，包括以下步骤：
[0011] 获取已经脱离人体的孕妇外周血，离心，吸取血浆，并将所述血浆置于零下60°c~ 零下100°C的环境中保存；
[0012] 提取所述血浆的蛋白质，得到待测液；
[0013] 测定所述待测液的蛋白质含量；
[0014] 将所述待测液进行免疫印迹检测；
[0015] 统计分析所述免疫印迹检测结果，建立所述唐氏综合征图谱模型。
[0016] 在其中一个实施例中，所述提取所述血浆的蛋白质包括以下步骤：将所述血浆与 双蒸水按体积比为1:1混合，摇匀后得到混合液，并将所述混合液与5XSDS-PAGE上样缓冲 液按体积比4 :1混合，煮沸lOmin，缓慢恢复至室温后，置于零下20°C环境中保存。
[0017] 在其中一个实施例中，所述孕妇外周血的体积为2~4mL。
[0018] 在其中一个实施例中，所述孕妇外周血的体积为3mL。
[0019] 在其中一个实施例中，所述离心的温度为4°C，转速为10000~150000转/分钟， 尚心时间为10~20分钟。
[0020] 在其中一个实施例中，将所述血浆置于零下80°C的环境中保存。
[0021] 在其中一个实施例中，采用BCA法测定所述待测液的蛋白质含量。
[0022] 在其中一个实施例中，测定所述待测液的蛋白质含量，包括以下步骤：
[0023] 配制不同浓度的BSA标准溶液；
[0024] 将待测液进行稀释；
[0025] 配制BCA工作液；
[0026] 将BSA标准溶液及已稀释的待测液分别加入至96孔板中，再加入BCA工作液，在 温度为37°C，避光的条件下，孵育30分钟；
[0027] 用酶标仪测定波长为560nm时的吸光度值；
[0028] 绘制标准曲线，并计算得出待测液中蛋白质的浓度。
[0029] 在其中一个实施例中，所述免疫印迹检测具体包括如下步骤：电泳、转膜、封闭、一 抗孵育、二抗孵育及显色。
[0030] 在其中一个实施例中，所述唐氏综合征图谱模型包括ApolipoproteinE，Serum amyloidP-component，ComplementfactorB，2-oxoglutaratedehydrogenase-like，mitochondrial，Nucleosomeassemblyprotein1-likel〇
[0031] 上述唐氏综合征图谱模型的构建方法，利用母血血浆中蛋白质的差异性表达，为 产前筛查和产前诊断唐氏综合征提供作为中间结果的唐氏综合征图谱模型信息，具有较高 的特异性和敏感性，且这些差异表达的蛋白质有助于阐明疾病的发病机理，及为唐氏胎儿 的早期诊断提供部分辅助依据。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明一实施例的唐氏综合征图谱模型的构建方法示意图；
[0033] 图2为本发明一实施例的蛋白质浓度的标准曲线图；
[0034] 图3为本发明一实施例的孕唐氏综合征孕妇外周血血浆蛋白质的免疫印迹检测 图；
[0035] 图4为本发明一实施例的孕正常胎儿孕妇外周血血浆蛋白质的免疫印迹检测图；
[0036] 图5为本发明一实施例的血浆中蛋白质在DS组及NC组中差异性表达的柱状图。
【具体实施方式】
[0037] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明 的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发 明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不 违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0038] 本发明提供一种唐氏综合征图谱模型的构建方法，包括：获取已经脱离人体的孕 妇外周血，离心，吸取血浆，并将所述血浆置于零下60°C~零下100°C的环境中保存；提取 所述血浆的蛋白质，得到待测液；测定所述待测液的蛋白质含量；将所述待测液进行免疫 印迹检测；统计分析所述免疫印迹检测结果，建立所述唐氏综合征图谱模型