[0031]一定浓度的O型红细胞与抗D (IgG)抗体等体积混合，37°C孵育器，孵育30min，得到抗D (IgG)抗体致敏细胞，使用5倍体积生理盐水洗涤数次，去除多余的IgG，用红细胞保存液重悬至所需浓度，最后加入一定体积抗人球蛋白试剂混匀，得到抗IgG指示剂细胞。
[0032]3检测试剂卡的组装:
[0033]检测试剂卡主要有处理过的滤膜，吸水材料和塑料支架组成。其中塑料支架有三部分组成，一是盖子，二是加样板，三是吸水盒。加样板为一带有4个孔(孔径为0.5cm)的方形塑料板，可从试剂卡上拆除。带有不同抗原检测组和对照组细胞膜的滤膜贴在加样板的背部，虑膜上的抗原中心与塑料版上的样品孔相对映。在盖子和吸水盒里面填充了4cmX4cm的方形吸水材料。滤膜和吸水材料都是使用防水胶黏贴在塑料版上，防止加样和冲洗过程滤膜和吸水纸脱落或串位置。
[0034]组装后的不规则抗体检测试剂卡以如图2所示，其中加样孔1、I1、III为带有三组已知抗原的滤膜，加样孔IV为阳性对照孔，即滤膜上带有制敏细胞膜。如图2所示。
[0035]4血清或者血浆中不规则抗体试剂盒的样品检测
[0036]首先将检测卡(图2A)打卡，抽出加样卡(图2D)。然后将10-200 μ I血清或血浆样品滴加在加样卡的Ι、ΙΙ、ΙΙΙ膜上。滴加待检测样品后，置于37°c孵育箱，孵育l-40min，取出加样卡，将加样卡放置在盖子上，然后向每个样品膜缓慢加入50-500ul的冲洗液，冲洗除去未反应或多余的抗体。然后将加样卡插回吸水盒，再向加样孔中滴加10-200 μ I指示剂细胞，等待30s至Imin,向每个样品孔缓慢加入200_1000ul的冲洗液,待冲洗液被吸水纸吸收后，观察加样孔的颜色。
[0037]在加样孔上有显著的红色物质残留为阳性反应，说明血清含有与膜上抗原对应的抗体；加样垫上没有红色物质残留为阴性反应，则说明血清中不含与之对应的抗体。结合抗原与抗体特异性反应，抗人球蛋白实验原理，可以很容易得知待检测样品中的抗体。或者，也可以利用光信号或者电信号采集系统采集加样垫上残留的红色残留物质，然后可以对结果自动化判断，从而实现对批量血清或血浆样品的不规则抗体检测。
[0038]实施案例3
[0039]血小板抗体筛查检测试剂盒的制备以及检测方法
[0040]I在滤膜上固定血小板抗原
[0041]使用化学方法处理活化滤膜后，然后使用保护剂稀释后的血小板抗原(或血小板)滴加到1.5cmX 1.5cm滤膜的中心，然后37°C烘干处理并密封保存。
[0042]3检测试剂卡的组装:
[0043]检测试剂卡包括处理过的滤膜、吸水材料以及塑料支架组成。塑料支架有三部分组成，一是盖子，二是加样板，三是吸水盒。加样板为一带有4个孔(孔径为0.5cm)的方形塑料板，可从试剂卡上拆除。带有血小板抗原的滤膜贴在加样板的背部，虑膜上的抗原中心与塑料版上的样品孔相对映。在盖子和吸水盒里面填充了 4cmX4cm的方形吸水纸。滤膜和吸水纸都是使用防水胶黏贴在塑料版上，防止加样和冲洗过程滤膜和吸水纸脱落或串位置。
[0044]组装后的血小板抗体检测试剂卡以如图3所示，其中加样孔1、II为检测孔，加样孔III为阳性对照孔，加样孔IV为阴性对照孔。
[0045]3指示剂细胞的制备:
[0046]—定浓度的O型红细胞与抗D (IgG)抗体等体积混合，37°C孵育器，孵育30min，得到抗D (IgG)抗体致敏细胞，使用5倍体积生理盐水洗涤数次，去除多余的IgG，用红细胞保存液重悬至所需浓度，最后加入一定体积抗人球蛋白试剂混匀，得到抗IgG指示剂细胞。
[0047]4样品检测:
[0048]取出检测试剂盒的样品板，标记检测孔、阳性对照孔以及阴性对照孔，向检测孔滴加10-200 μ L的待测血清或血浆，向阳性对照孔滴加10-200 μ L阳性对照(含有抗人血小板抗体)，阴性对照孔滴加10-200 μ L阴性对照(不含抗人血小板抗体)，将样品板置于37°C的孵育器中孵育l_40min，再次滴加50-500 μ L的生理盐水，冲洗去除多余的血清或血浆。最后向反应孔中滴加10-200 μ I指示剂细胞，等待30s至lmin，向每个反应孔缓慢加入200-1000ul的冲洗液，待冲洗液被吸水纸吸收后，观察加样孔的颜色。
[0049]添加阳性对照的反应孔上应该有显著的红色物质残留，其原理是阳性对照中含有抗人血小板抗原可以血小板抗体结合，进而与指示剂细胞结合，将细胞截留在滤膜表面；添加阴性对照的反应孔，因为阴性对照中不合有抗人血小板抗体，因此不能截留指示剂细胞，没有红色物质残留。根据结合抗原与抗体特异性反应，抗人球蛋白实验原理，并且参考阳对照孔和阴对照孔结果，可以很容易得知待检测样品中是否含有抗人血小板抗体。
[0050]上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备，其特征在于，该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜的周边包围有吸水材料，检测时，将待检血清或血浆滴加到滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。当膜上的抗原特异性结合血清(血浆)中抗体后，可以与特定的指示细胞发生红细胞凝集反应，进而形成肉眼可见的红色团块。当膜上的抗原不与血清(血浆)中抗体结合，指示剂细胞就不会发生凝集，红细胞会被冲洗液分散，没有肉眼可见红色聚集块。操作人员可依据红细胞是否在滤膜形成肉眼可见的红色团块来判断结果，确定血清或者血浆中的抗体。指示剂红细胞和膜结构的结合，为反应提供了结果显示的方式。2.根据权利要求1所述的基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法，其特征在于，所述血清(血浆)抗体包括血型抗体、HLA抗体、血小板抗体。3.根据权利要求1所述的基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法，其特征在于，所述该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，而滤膜材质可以是玻璃纤维膜或硝酸纤维膜或硅酸盐颗粒等能够形成特定连续液流通道的固体，且滤膜的内径在2-20微米之间。4.根据权利要求1所述的基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法，其特征在于，所述滤膜的周边包围有吸水材料，吸水材料可以是吸水纸、棉花等，吸水材料包围滤膜的方式为全部包围或者部分包围。5.根据权利要求1所述的基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法，其特征在于，所述将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上的方法为物理吸附法或者化学交联法。6.根据权利要求1所述的基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法，其特征在于，所述的待检血清或血浆滴加到滤膜表面，其中的待检血清或血浆为体积约10-200 μ L的新鲜的人血清或者血楽；。7.根据权利要求1所述的基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法，其特征在于，所述的将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，其中指示剂细胞为保存在红细胞保存液或其他等渗溶液中的抗人球蛋白包被的血红细胞。指示剂红细胞的制备可以依据红细胞致敏的方法制作。根据实验要求，指示剂细胞浓度在0.5% -20%之间。8.用于完成根据权利要求1所述的基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒由检测卡以及指示剂细胞组成。其中检测卡内设有能够允许单个红细胞通过的滤膜，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜周边垫有吸水垫，吸水垫的面积要大于滤膜，且滤膜和吸水垫都通过塑料固体结构来做固定和支撑。而指示剂细胞则是抗人球蛋白包被的血红细胞。 检测时，将待检血清或血浆滴加到检测卡的滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。如果血清或者血浆中含有与滤膜上抗原发生特异性反应的抗体，血清或血浆中抗体将被结合到滤膜上，进而与指示剂细胞发生抗原抗体结合，指示红细胞则会留在膜表面形成肉眼可见的红色团块；反之，如果血清或者血浆中不含与滤膜上抗原发生特异性反应的抗体，对应的反定型指示剂细胞不会发生抗原抗体结合，指示剂红细胞将会随冲洗液液体渗出，则滤膜上不会形成肉眼可见的红色团块。
【专利摘要】本发明公开了一种基于膜结构的血清(血浆)抗体筛查方法以及筛查检测试剂盒的制备，其特征在于，该方法选用能够允许单个红细胞通过的滤膜作为核心材料，将细胞、细胞碎片或者纯化抗原结合到滤膜上，滤膜的周边包围有吸水材料，检测时，将待检血清或血浆滴加到滤膜表面，孵育一定时间后，微量冲洗液冲洗后，再将特定的指示剂细胞滴加到滤膜表面，最后使用冲洗液冲洗。本发明的有益效果是，检测时间短，结果客观。
【IPC分类】G01N33/96, G01N33/80
【公开号】CN104950114
【申请号】CN201410122813
【发明人】黄志刚
【申请人】天津德祥生物技术有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月31日