量瓶中，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到甲基转移酶固定液；
(5)固载甲基转移酶电极传感器的制备方法:取步骤(4)制备的甲基转移酶固定液滴涂到步骤(3)制备的氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极上，滴涂的量为25 yL，在5~8°C干燥，即得固载甲基转移酶电极传感器。
[0016]实施例2
(1)铂电极预处理:将直径为3mm的铂盘电极，对电极、参比电极均使用直径为0.5 mm的Pt丝依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥浆抛光打磨成镜面，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗5 min，以清洗后的铂盘电极做为工作电极，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度从-0.2到+1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描至稳定，得到预处理铂电极；
(2)聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中分别加入20g的3-噻吩乙酸25mL的N-甲基吡咯烷酮溶解后，通入15min氮气除氧，除氧后，加入1.0 mL三氟化硼乙醚作为电解质，将预处理电极放入，采用计时电流法在电压为1.4 V，时间为70 s的条件下合成3-噻吩乙酸膜电极，将合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小时以除去电极上的溶剂，得到聚3-噻吩乙酸膜电极；
(3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中，分别加入，氯化亚砜:6mL，N，N-二甲基甲酰胺:1.5mL，混合均匀，将聚3-噻吩乙酸膜电极放入，室温反应24h，温度升到55°C恒温反应4h，滴加乙二胺:1.01^，再于55°〇恒温反应2 h，取出电极，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤，于60°C干燥，放入质量百分浓度为12%的戊二醛溶液中，超声50min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极；
(4)甲基转移酶固定液的制备:准确称取600mg甲基转移酶和600mgDNA于小烧杯中，加入20 mL左右pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液使其溶解，定量转移到50.0 mL的容量瓶中，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到甲基转移酶固定液；
(5)固载甲基转移酶电极传感器的制备方法:取步骤(4)制备的甲基转移酶固定液滴涂到步骤(3)制备的氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极上，滴涂的量为22 yL，在5~8°C干燥，即得固载甲基转移酶电极传感器。
[0017]实施例3 (1)铂电极预处理:将直径为3mm的铂盘电极，对电极、参比电极均使用直径为0.5 mm的Pt丝依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥浆抛光打磨成镜面，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗5 min，以清洗后的铂盘电极做为工作电极，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度从-0.2到+1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描至稳定，得到预处理铂电极；
(2)聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中分别加入15g的3-噻吩乙酸22mL的N-甲基吡咯烷酮溶解后，通入20min氮气除氧，除氧后，加入0.5 mL三氟化硼乙醚作为电解质，将预处理电极放入，采用计时电流法在电压为1.4 V，时间为90 s的条件下合成3-噻吩乙酸膜电极，将合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小时以除去电极上的溶剂，得到聚3-噻吩乙酸膜电极；
(3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中，分别加入，氯化亚砜:16mL，N，N-二甲基甲酰胺:4mL，混合均匀，将聚3-噻吩乙酸膜电极放入，室温反应30h，温度升到60°C恒温反应5h，滴加乙二胺:4.0mL，再于58°C恒温反应3 h，取出电极，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤，于60°C干燥，放入质量百分浓度为12%的戊二醛溶液中，超声60min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极；
(4)甲基转移酶固定液的制备:准确称取750mg甲基转移酶和750mgDNA于小烧杯中，加入20 mL左右pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液使其溶解，定量转移到50.0 mL的容量瓶中，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到甲基转移酶固定液；
(5)固载甲基转移酶电极传感器的制备方法:取步骤(4)制备的甲基转移酶固定液滴涂到步骤(3)制备的氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极上，滴涂的量为30 yL，在5~8°C干燥，即得固载甲基转移酶电极传感器。
[0018]实施例4
(1)铂电极预处理:将直径为3mm的铂盘电极，对电极、参比电极均使用直径为0.5 mm的Pt丝依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥浆抛光打磨成镜面，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗5 min，以清洗后的铂盘电极做为工作电极，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度从-0.2到+1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描至稳定，得到预处理铂电极；
(2)聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中分别加入12g的3-噻吩乙酸14mL的N-甲基吡咯烷酮溶解后，通入15min氮气除氧，除氧后，加入1.0 mL三氟化硼乙醚作为电解质，将预处理电极放入，采用计时电流法在电压为1.4 V，时间为80 s的条件下合成3-噻吩乙酸膜电极，将合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小时以除去电极上的溶剂，得到聚3-噻吩乙酸膜电极；
(3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中，分别加入，氯化亚砜:12mL，N，N-二甲基甲酰胺:3.0mL，混合均匀，将聚3-噻吩乙酸膜电极放入，室温反应24h，温度升到55°C恒温反应4h，滴加乙二胺:2.5mL，再于55°C恒温反应2 h，取出电极，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤，于60°C干燥，放入质量百分浓度为12%的戊二醛溶液中，超声50min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极；
(4)甲基转移酶固定液的制备:准确称取700mg甲基转移酶和700mgDNA于小烧杯中，加入20 mL左右pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液使其溶解，定量转移到50.0 mL的容量瓶中，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到甲基转移酶固定液；
(5)固载甲基转移酶电极传感器的制备方法:取步骤(4)制备的甲基转移酶固定液滴涂到步骤(3)制备的氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极上，滴涂的量为25 yL，在5~8°C干燥，即得固载甲基转移酶电极传感器。
[0019]实施例5
将上述实施例1~4所制备的固载甲基转移酶电极传感器，用于药品中SAM的检测，步骤如下:
(1)标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的SAM标准溶液，底液为pH7.2的磷酸盐缓冲溶液；
(2)工作曲线绘制:将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，采用计时电流法扫描该溶液，工作电压为-1.1V，去个不同浓度下SAM的峰电流值与SAM浓度做工作曲线，工作曲线的回归方程为1=0.0092+0.204c ( μ mol/L)，相关系数R=0.9990，检测的线性范围为2~25 ymol/L，检出限 0.51 μ mol/L ；
(3)SAM的检测:取思美泰药片20片，研磨后，用去离子水浸去I小时，过滤，滤液定容在250 mL容量瓶中，测定时稀释到工作曲线范围内，用待测样品代替步骤(I)中的SAM标准溶液，按照步骤(2)的方法进行检测，根据响应电流值和工作曲线，得到待测样品中SAM的含量；回收率在95.15-105.2%之间。
[0020]本发明制备的固载甲基转移酶电极传感器成功用于药品、食品中SAM的检测中，回收率在95.15-105.2%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域，解决了 SAM检测的困难。
【主权项】
1.一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，特征在于，该方法具有以下工艺步骤: (1)铂电极预处理:将直径为3mm的铂盘电极，对电极、参比电极均使用直径为0.5 mm的Pt丝依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥浆抛光打磨成镜面，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗5 min，以清洗后的铂盘电极做为工作电极，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度从-0.2到+1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描至稳定，得到预处理铂电极； (2)聚3-噻吩乙酸膜电极制备:将含有3-噻吩乙酸的质量百分浓度为35~45%的N-甲基吡咯烷酮溶液通入氮气除氧15~20min除氧后，加入0.5-1.0 mL三氟化硼乙醚作为电解质，将预处理电极放入，采用计时电流法在电压为1.4 V，时间为70-90 s的条件下合成3-噻吩乙酸膜电极，将合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小时以除去电极上的溶剂，得到聚3-噻吩乙酸膜电极； (3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，氯化亚砜:60~75%，N, N- 二甲基甲酰胺:5~12%，混合均勾，将聚3-噻吩乙酸膜电极放入，室温反应24~30h，温度升到55~60°C恒温反应4~5 h，滴加乙二胺:18~30%，再于55~60°C恒温反应2~3 h，取出电极，用N，N- 二甲基甲酰胺洗涤，于60°C干燥，放入质量百分浓度为12%的戊二醛溶液中，超声50~60min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极； (4)甲基转移酶固定液的制备:在反应器中，按甲基转移酶与DNA质量比为1:1加入，甲基转移酶与DNA溶解在pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液中，溶液中含甲基转移酶与DNA的浓度都在12~15mg/mL范围内，该溶液为甲基转移酶固定液； (5)固载甲基转移酶电极传感器的制备方法:取步骤(4)制备的甲基转移酶固定液滴涂到步骤(3)制备的氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极上，滴涂的量为22~30 yL，在5~8°C干燥，即得固载甲基转移酶电极传感器。2.根据权利要求1所述的一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，特征在于，步骤(4)所述的甲基转移酶为E.C.2.1.1.3型甲基转移酶。3.根据权利要求1所述的一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法所制备的固载甲基转移酶电极传感器，特征在于，所制备的固载甲基转移酶电极传感器用于样品中SAM的测定。
【专利摘要】本发明公开了一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，其特征是：（1）将预处理的铂盘电极采用电化学聚合法制备聚3-噻吩乙酸膜电极；（2）然后将聚3-噻吩乙酸膜电极氨基化；（3）再将氨基化的聚3-噻吩乙酸膜电极交联方法固载甲基转移酶，得到固载甲基转移酶电极传感器。用该电极快速检测样品中SAM，该方法灵敏度高、选择性好、响应时间短、干扰少，优于其它检测方法，是一种简单快速、方便易行的SAM测定方法，本申请制备的固载甲基转移酶电极传感器成本低、特异性好，具有实现自动化现场测定的潜力。
【IPC分类】G01N27/327
【公开号】CN104990973
【申请号】CN201510389596
【发明人】李慧芝, 李志英, 杨春霞
【申请人】济南大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月6日