F/MS，USA)。以电喷雾离 子源（ESI)正、负离子模式检测；干燥气流速为7L/min，干燥气温度为300°C，干燥气和锥孔 气均为高纯氮气；离子源温度l〇〇°C，正离子和负离子模式下毛细管电压均为为3000V，碰 撞电压为100V ;采用全扫描模式每秒进行三次数据采集，扫描质量范围：m/z 100-1000道 尔顿。
[0051] 数据处理和分析
[0052] 将 GC-Q/MS 和 UPLC-Q/TOF-MS 得到的数据导入 SMCA 软件（version 13. 0? 2， Umetrics)进行多元统计分析。通过建立0PLS-DA(正交偏最小二乘法-判别分析）模型， 我们发现区分Luminal B和HER2过表达型之间及Luminal A和Basal-like型之间代谢轮 廓贡献较大的差异代谢物，前者有6种，后者5种，其中有2个共有差异代谢物。如图1所 不〇
[0053] 通过HMDB(http ://www. hmdb. ca/)和 Metline (http ://metlin. scripps. edu/) 等数据库进行物质结构的检索，利用数据库中提供的精确分子量和上述所得的MS/MS图谱 缩小来自乳腺癌分子亚型的生物标志物与数据库结构物质的可能范围，提高两者的匹配程 度。最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对， 对乳腺癌分子亚型的生物标志物进行结构表征和确认。
[0054] 鉴定表征的9个化合物，即脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸、缬氨酸、哌啶 酸、甘氨酸、甘氨鹅去氧胆酸及棕榈酸，他们的色谱保留时间与标准品的保留时间一致，并 且其多级质谱碎片信息与标准品的结构特征相吻合。
[0055] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：哌啶酸、缬氨酸在制备区 分乳腺癌亚型生物标志物的组合物的应用。
[0056] 本发明涉及将脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸、哌啶酸及缬氨酸用于制备 区分乳腺癌Luminal B型vs HER2过表达型生物标志物的组合物；本发明涉及将哌啶酸、甘 氨酸、甘氨鹅去氧胆酸、棕榈酸及缬氨酸用于制备区分Luminal A型vs Basal-like型生物 标志物的组合物。结果见表1。
[0057] 表 1?区分乳腺癌LuminalB型vsHER2 过表达型及LuminalA型vsBasal-like 型的生物标志物汇总
[0058]
[0059] 验证：
[0060] 进一步采用受试者工作曲线（ROC)法检验缬氨酸、哌啶酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨 酸和棕榈酸五种生物标志物对Luminal A型和Basal-like型乳腺癌之间的诊断准确率。
[0061] 结果显示：训练集中，曲线下面积为0. 969 (灵敏度92. 3%、特异性90. 0% );测试 集中，曲线下面积为0. 959 (灵敏度85. 7%、特异性92. 9% )。在训练集中，基于最优灵敏度 和特异性，得到的最优临界值（cut-off value)为0.518。运用该临界值进行样本预测，结 果显示：此五种生物标志物组对训练集的预测准确率为90. 0% (Luminal A型）和80. 0% (Basal-like 型），对测试集的预测准确率为90. 9% (Luminal A型）和 87. 5% (Basal-like 型）。结果如图2所示。
[0062] 综上所述，本发明为通过血浆代谢组学为临床上预测乳腺癌的分子亚型提供了一 组新的生物标志物，这种方法具有快速、简便、经济及无创的优点。
[0063] 上述研宄方法相较于传统的乳腺癌诊断方法具有快速、简便、经济且相对无创等 优点。
[0064] 本发明对于预测乳腺癌分子亚型具有重要意义，为乳腺癌临床诊断、个体化治疗 及预后评价提供重要依据。
【附图说明】
[0065] 图1 :实施例1中Luminal B型vs HER2过表达型（A)及Luminal A型vs Basal-like型（B)乳腺癌患者的0PLS-DA得分图。
[0066] 图2 :实施例2中缬氨酸、哌啶酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨酸和棕榈酸五种生物标志 物在训练集和测试集对Luminal A型和Basal-like型乳腺癌患者的诊断准确率验证图。
[0067] 图1-2的具体解释
[0068] 图1的A为：Luminal B型与HER2过表达型乳腺癌在UPLC-Q/TOF-MS正离子模式、 负离子模式、GC-MS下0PLS-DA图；
[0069] 图1的B为：Luminal A型与Basal-like型乳腺癌在UPLC-Q/TOF-MS正离子模式、 负离子模式、GC-MS下0PLS-DA图；
[0070] 图2的A为：训练集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌受试者工作曲线
[0071] 图2的B为：测试集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌受试者工作曲线
[0072] 分别为训练集和测试集的R0C(受试者工作特征）曲线，AUC(曲线下面积）的值 揭示了 0PLS-DA模型的诊断准确性；
[0073] 图2的C为：训练集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌预测情况
[0074] 图2的D为：测试集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌预测情况
[0075] 显示训练集和测试集R0C分析得到的Cut off value (截断点），0和1分别代表 Luminal A型和Basal-like型乳腺癌患者。 具体实施例[0076] 实施例1
[0077] 用于区分LuminalB型及HER2过表达型乳腺癌的生物标志物组合，其组成及相对 峰强度如表2所不：
[0078] 表2 Luminal B型vs HER2过表达型乳腺癌差异代谢物
[0079]
[0080] aVIP变量重要性投影；bEIC提取离子流；。HER2过表达型相对于Luminal B型乳腺 癌差异代谢物提取离子流峰强度变化趋势。
[0081] 实施例2
[0082] 用于区分LuminalA型及Basal-like型乳腺癌的生物标志物组合，其组成及相对 峰强度如表3所不：
[0083] 表3 Luminal A型vs Basal-like型乳腺癌差异代谢物
[0084]
[0085] aVIP变量重要性投影；bEIC提取离子流；。Basal-like型相对于Luminal A型乳腺 癌差异代谢物提取离子流峰强度变化趋势。
【主权项】
1. 一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 哌啶酸、缬氨酸在制备区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物的应用。2. 根据权利要求1的一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 哌啶酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸在制备区分Luminal B型和 HER2过表达型乳腺癌的标志物的组合物的应用。3. 根据权利要求2的一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 分别检测HER2过表达型、Luminal B型患者的离体血浆 与HER2过表达型相比，Luminal B型的哌啶酸下调，缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨 酸、2-辛烯二酸上调。4. 根据权利要求2的一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 单位：提取离子流强度 哌啶酸：Luminal B 型 2156672±45553、HER2 过表达型 2198270±79503 ; 缬氨酸：Luminal B 型 1368882 ± 182218、HER2 过表达型 1233138 ±265196 ; 脯氨酸：Luminal B 型 1325183 ± 55489、HER2 过表达型 1311271 ±79206 ; 异亮氨酸：Luminal B 型 325054±5322、HER2 过表达型 224589±9743 ; 亮氨酸：Luminal B 型 2548628±130655、HER2 过表达型 2301808±90442 ; 2-辛烯二酸：Luminal B 型 1126470±42105、HER2 过表达型 1109990±70424。5. 根据权利要求4的一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 哌啶酸、缬氨酸、甘氨酸、甘氨鹅去氧胆酸、棕榈酸在制备区分Luminal A型和 Basal-Iike型乳腺癌的标志物的组合物的应用。6. 根据权利要求4的一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 分别检测Luminal A、Basal-Iike型患者的离体血衆 与Basal-Iike型相比，Luminal A型患者血衆中结I氨酸含量明显上调，哌啶酸、甘氨 酸、甘氧鹅去氧胆酸及棕榈酸明显下调。7. 根据权利要求4的一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 单位：提取离子流强度 哌啶酸：Luminal A 型 217914±99803、Basal-Iike 型 256884± 119445 ; 缬氨酸：Luminal A 型 1152199±294556、Basal-Iike 型 892569± 141893 ; 甘氨酸提取：Luminal A 型 361960± 164984、Basal-Iike 型 487493± 144298 ; 甘氨鹅去氧胆酸：Luminal A 型 19579± 1680、Basal-Iike 型 27315± 1922 ; 棕榈酸提取：Luminal A 型 264688±43895、Basal-Iike 型 292127±35745。8. 根据权利要求1-7的一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物，其特征在于： 应用液相色谱质谱联用、气相色谱质谱联用技术的非靶向代谢组学分析； 结合多元数据分析处理方法； 寻找患者血浆中表征乳腺癌分子分型的内源性小分子生物标志物组合，从而对乳腺癌 Luminal A 型 vs Basal-Iike 型、Luminal B 型 vs HER2 过表达型进行区分。
【专利摘要】本发明基于乳腺癌不同分子亚型的患者血浆代谢组学研究，发现可用于区分Luminal B型vs HER2过表达型、Luminal A型vs Basal-like型乳腺癌的生物标志物。与HER2过表达型相比，Luminal B型患者血浆中脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸及缬氨酸明显上调，哌啶酸明显下调；与Basal-like型相比，LuminalA型患者血浆中缬氨酸含量明显上调，哌啶酸、甘氨酸、甘氨鹅去氧胆酸及棕榈酸明显下调。本发明能够快速预测乳腺癌分子亚型，为乳腺癌的临床诊断、治疗及预后评价提供重要依据。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN104991010
【申请号】CN201510459243
【发明人】齐炼文, 李进, 朱伟, 范勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月29日