专利名称：PRRSV、SIV H9亚型与PCV2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及PRRSV、SIV H9亚型与PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR引物及其检测方法。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育，即公猪睾丸肿胀，精液质量下降，失去种用能力；母猪表现为不发情，返情，不孕；妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等，给养猪业造成了巨大的经济损失。SIV能引起人兽共患病的发生和传播，威胁人类安全。对这类传染病的有效控制是保证人类公共安全和养猪业健康发展的关键因素之一。目前，国内外对以上三种病毒已经有大量的相关研究，建立了病毒分离、ELISA检测方法、免疫组化法、免疫荧光法等方法，以及以分子生物学为基础的检测方法，如PCR、套式PCR和竞争PCR等。但这些方法都存在这样那样的缺点病毒分离耗时、原位杂交操作繁琐等，PCR虽然有较高的特异性和敏感性，但容易出现假阴性结果，而且不能定量，往往漏检隐性感染的动物，造成疾病的蔓延。TaqMan探针方法能够定量，但成本较高，不利于推广。 临床上，这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，对仪器的操作要求较高，所需时间长，亟需一种操作简单、快速的检测、准确率高的鉴别方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是PRRSV、SIV H9亚型与PCV2这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，提供一种 PRRSV, SIV H9亚型与PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR引物及其检测方法。本发明的技术方案是PRRSV、SIV H9亚型与PCV2多重STOR Green I实时荧光 PCR引物SIV H9亚型引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3:5' -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4:5' -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物P6:5' -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3‘。所述引物检测PRRSV、SIV H9亚型与PCV2的多重STOR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测 所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份
SYBR Premix Ex Taq II14.5 “L
？ VP3^50.5+0.5+0.5μ
p2^4/P60.5+0.5+0.5μ
DNA1+1+1 μL
ddH204.5μΙ>
25 \iL所述反应条件为95°C预变性Imin ；进入循环，95°C变性10s，56°C退火15s，72°C延伸15s，40个循环，反应结束后先加热至95°C，然后再降至65°C，开始以0. 5°C /sec递增至94°C检测荧光信号，进而得出扩增产物的熔解曲线。本发明的有益效果是本发明分别设计扩增PRRSV、SIV H9亚型和PCV2的特异性引物，通过三重STOR Green I实时定量PCR检测方法能够同时检测出PRRSV、SIV H9亚型和PCV2，本发明利用TM值来区分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要与GC含量、序列长度和结构有关。PRRSV的扩增片段基因序列长208bp，达到了 87°C左右；SIV扩增片段209bp，TM值最高，在90°C左右；PCV2的扩增片段为171bp，TM值在85°C左右，PRRSV、SIVH9亚型和PCV2的TM值可以很好的区分。在本发明中，PRRSV扩增片段的TM值、SIV H9亚型扩增片段的TM值和PCV2扩增片段的TM值会在一定的温度范围内波动，PRRSV的TM值变化范围为86. 9-87. 2V，SIV H9亚型的TM值变化范围为90. 2-90. 50C，PCV2的TM值变化范围为85. 2-85. 6V,3种病毒的TM值相差较大，因此可以利用熔解曲线的三个特异性的峰对这3种病毒进行鉴别。本发明的敏感性表明，PRRSV、SIV H9亚型和PCV2同时检出的极限拷贝数分别为187拷贝/ μ L，191拷贝/ μ L，203拷贝/ μ L。本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性并且本试验的最大优势在于能够同时检测PRRSV、SIV H9亚型和PCV23种DNA病毒，有利于这3种病毒的鉴别。本发明建立了检测PRRSV、SIV H9亚型和PCV2多重STOR Green I荧光定量PCR方法，结果表明，该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性，为PRRSV、SIV H9亚型和PCV2的检测提供了一种新的方法，可作为规模化猪场PRRSV、SIV H9亚型和PCV2的净化检测方法，建立无PRRSV、SIV H9亚型和PCV2的猪群，同时也为PRRSV、SIV H9亚型和PCV2感染的分子流行病学调查，研究PRRSV、SIV H9亚型和PCV2分子发病机理，PRRSV、SIV H9亚型和PCV2诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。
图1是PRRSV部分基因质粒PCR鉴定结果，M. DL 2000Marker, 1.阴性对照，2.目的片段；图2是SIV H9亚型部分基因质粒PCR鉴定结果，M. DL 2000Marker, 1.阴性对照，2.目的片段；图3是PCV2部分基因质粒PCR鉴定结果，M. DL 2000Marker, 1.阴性对照，2.目的片段；图4是复合STOR Green I荧光定量PCR反应熔解曲线分析；图5是多重STOR Green I荧光定量PCR反应特异性试验熔解曲线分析；图6是复合STOR Green I荧光定量PCR反应同浓度重复性试验熔解曲线分析；图7是不同浓度重复性试验熔解曲线分析；图8是不同浓度重复性试验熔解曲线分析；图9是不同浓度重复性试验熔解曲线分析。
具体实施例方式PRRSV, SIV H9 亚型与 PCV2 多重 STOR Green I 实时荧光 PCR 引物SIV H9亚型引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4 5 ‘ -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；
下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘；所述引物检测PRRSV、SIV H9亚型与PCV2的多重STOR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份
权利要求
1.PRRSV, SIV H9亚型与PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR引物，其特征在于SIV H9亚型引物的序列如下上游引物 P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物 P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物 P3 5 ‘ AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物 P4 5 ‘ CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物 P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘。
2.利用权利要求1所述引物检测PRRSV、SIVH9亚型与PCV2的多重STOR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份
全文摘要
本发明公开了一种PRRSV、SIV H9亚型与PCV2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR·引物，SIV H9亚型引物的序列如下上游引物P15′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P25′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；PRRSV引物的序列如下上游引物P35′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′；下游引物P45′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′；PCV2引物的序列如下上游引物P55′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P65′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。本发明分别设计扩增PRRSV、SIV H9亚型和PCV2的特异性引物，通过三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法能够同时检测出PRRSV、SIV H9亚型和PCV2，PRRSV、SIV H9亚型和PCV2同时检出的极限拷贝数分别为187拷贝/μL，191拷贝/μL，203拷贝/μL。本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性并且本试验的最大优势在于能够同时检测PRRSV、SIV H9亚型和PCV23种DNA病毒，有利于这3种病毒的鉴别。
文档编号C12Q1/68GK102373296SQ20111022171
公开日2012年3月14日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者刘芳, 崔保安, 李明凤, 陈红英, 韩志涛, 魏战勇 申请人:河南农业大学