L2多表位融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及L2多表位融合蛋白及其应用。具体而言，本发明涉及包含乳头瘤病毒的L2表位和通用性辅助性T淋巴细胞的串联体和IgG亚型重链基因的改造突变体的融合蛋白、其编码核苷酸、包含所述编码核苷酸的pFastBac1重组质粒、包含所述pFastBac1重组质粒构建的重组Bacmid、包含所述的重组Bacmid的DH10Bac大肠杆菌、由上述组分制备的HPV预防性疫苗及其用途。本发明可以用于HPV感染及HPV感染相关疾病的免疫预防，具有重要的经济及社会意义。
【专利说明】L2多表位融合蛋白及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及L2多表位融合蛋白及其应用。具体而言，本发明涉及包含人乳头瘤病 毒L2抗原蛋白序列和改造抗体的重链蛋白序列的融合蛋白及其应用。 【背景技术】
[0002] 目前已分离鉴定了 100多型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV)，其中 1/3的为嗜黏膜病毒，其中包括诱发恶性增生的高危型HPV，其感染与宫颈、肛周、阴道、阴 唇、阴茎及口咽癌的发生密切相关，计15种型别，在宫颈癌组织中检出的阳性率由高至底 依次为：HPV16、18、45、31、33、52、58、35、59、56、39、51、73、68、66 ;还包括 12 种诱发尖锐湿 疣等良性病变的低危型（即￥6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、89)、中间型或可疑高危 型（HPV34、57、83)，及尚未确定型（HPV34、57、83)。其余的为嗜皮肤病毒，如HPV5型，主要诱 发皮肤疣状增生。宫颈癌是世界范围第三高发的妇女恶性肿瘤，年发病率约50万，其中亚 洲地区23. 5万；中国的年发病数10万，诱发中国妇女宫颈癌的主要高危型依次为HPV16、 18、58、52、33等。现有上市的HPV病毒样颗粒疫苗仅靶向HPV16及18两种高危型，诱发的 保护反应主要是疫苗涵盖型别特异的，且成本高。因此研发广谱的HPV疫苗意义重大。
[0003] L2蛋白是病毒次要外壳蛋白，含有保守的中和抗体表位，诱发产生的抗体常具 有交叉中和活性及免疫保护作用。目前鉴定的HPV16L2保守中和抗体表位有aa. 17-36、 &&.108-120、&3.64-81及33.56-75等，其中33.17-36为免疫优势表位（六1卩]18冊，631]113]1；^& R，Karanam B，et al.Proc Natl Acad Sci USA2008; 105:5850 - 5855.)。但L2合成肽或重组 蛋白免疫诱发产生的中和抗体的滴度很低。目前报道的提高L2表位免疫活性的方法有：1、 构建含改造 TLR2配体及Th表位的呈分支状结构的HPV16L2a. a. 17-36脂肽疫苗，可显著提 高表位的免疫原性；2、将不同乳头瘤病毒来源的22拷贝的aal7-36串联表位直接串联，免 疫效果则很差（Jagu S，Karanam B，Gambhira R，et al.J Natl Cancer Inst. 2009; June2;l 01 (11) :782 - 792.)。提示仅通过增加表位的数目而缺乏有效的呈递方式对疫苗活性的加强 效果并不理想；3、选择具有免疫刺激活性的蛋白为载体，如HPV L1病毒样颗粒（Christina S，Roden R and Kirnbauer R.J. Virol. 2009; 83 (19) :10085.)或细菌硫氧还蛋白（Rubio I，Bolchi A, Moretto N，et al. Vaccine. 2009; 27 (13) :1949-56.)，构建表面展示嵌合L2 表 位的蛋白疫苗，可显著提高L2表位诱导产生中和抗体的能力。通用型Th表位能与大多数 人HLA-DR及小鼠 MHC II分子高亲和力结合，可有效活化Th细胞，促进B细胞更好的完全活 化（Alexander J, del Guercio MF，Maewal A，et al.J Immunol. 2000;164(3):1625_33·)， 常被用在合成肽疫苗中，以提高表位的免疫原性。上述数据提示与具有免疫刺激活性的分 子融合并表面展不融合表位可以强化L2表位的免疫原性。
[0004] IgG受体（Fc YR)是专职抗原呈递细胞表面到达的分子，可与免疫复合物或IgG单 体的Fc段结合，促进B细胞活化，显著提高抗原特异性的抗体水平。在四种亚型的Fc γ R 中，以Fc γ RI对IgG单体的亲和力最强，与Fc γ RI的结合区位于IgG绞链区及CH2结构 区（HCH2)。研究发现用四个拷贝HCH2替换IgG重链的VH-CH1段获得的改造重链，经Fc 段介导形成的二聚体与Fc γ R的亲和力显著提高，在其N端融合人血清白蛋白获得的重链 Fc段融合蛋白，免疫后可显著增强血清白蛋白特异性的细胞免疫和体液免疫反应（Jensen ΜΑ, Arnason BG, White DM. Eur.J. Immunol. 2007, 37:1139-1148)。因此，改造后的 IgG 重链 蛋白是极具吸引力的疫苗载体，目前尚未见有将其用于HPV疫苗的报道。由于抗原表位的 呈递效率及融合蛋白的空间结构、生物活性等性质受到其氨基酸一级序列的巨大影响，优 化改造的L2表位与改造抗体融合后是否能被有效呈递，基因工程改造抗体是否人具有免 疫刺激活性，只能依靠具体的实验研究才能确定。因此，改造抗体能否用于HPV L2疫苗以 提高其免疫原性需要具体的探索才能确定。
【发明内容】
[0005] 因此，本发明的目的在于获得改造抗体和HPV的L2抗原蛋白融合的融合蛋白，并 研究其在预防HPV感染和HPV感染相关疾病中的用途。
[0006] 因此，本发明的第一方面涉及一种融合蛋白，其包含乳头瘤病毒的抗原蛋白和改 造的抗体蛋白序列，其中乳头瘤病毒的抗原蛋白是人乳头瘤病毒的L2表位和通用性辅助 性T淋巴细胞的串联体且在所述串联体的上游融合有gp67信号肽序列，改造的抗体蛋白选 自所有IgG亚型重链基因的改造突变体，改造抗体是用含四个重复拷贝的铰链区-CH2区的 序列取代IgG重链的VH-CH1区获得，优选地，所述IgG亚型是人的IgGl，优选地，所述串联 体与IgG重链基因的突变体间以GGP连接子相连。
[0007] 优选地，所述乳头瘤病毒选自高危型HPV和低危型HPV，优选地，高危型HPV选 自 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 及 12 ;更优选地，高危型 HPV 是 HPV16。
[0008] 优选地，所述串联体是由3个HPV16L2aa. 17-36表位及一个通用型辅助性T淋 巴细胞表位依次串联而获得，L2表位之间以GGP连接子连接，L2表位串与Th表位之间以 Xhol-Kpnl位点及GGP相连，优选地，所述通用型辅助性T淋巴细胞表位的序列如SEQ ID NO :3所示。
[0009] 最优选地，所述融合蛋白的序列如SEQ ID N0 :2所示。
[〇〇1〇] 本发明的第二方面涉及上述第一方面所述的融合蛋白的编码核苷酸，优选地，所 述编码核苷酸的序列如SEQ ID N0 :1所示。
[〇〇11] 本发明的第三方面涉及一种有效连接有上述第二方面所述的编码核苷酸的 pFastBacl重组质粒。
[0012] 本发明的第四方面涉及一种包含利用上述第三方面所述pFastBacl重组质粒构 建的重组Bacmid。
[0013] 本发明的第五方面涉及一种包含上述第四方面所述的重组Bacmid的DHlOBac大 肠杆菌。
[0014] 本发明的第六方面涉及一种利用上述第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的 编码核苷酸、第三方面所述的pFastBacl重组质粒、第四方面所述的重组Bacmid或第五方 面所述的DHlOBac大肠杆菌制备的HPV预防性疫苗。
[0015] 本发明的第七方面涉及一种第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的编码核苷 酸、第三方面所述的pFastBacl重组质粒、第四方面所述的重组Bacmid或第五方面所述的 DHlOBac大肠杆菌在制备用于预防HPV感染或者HPV感染相关疾病的药物中的用途。
[0016] 换言之，本发明的第一方面涉及一种融合蛋白，其包含乳头瘤病毒的抗原蛋白和 改造抗体蛋白序列。
[0017] 优选地，所述改造抗体选自所有IgG亚型重链基因的改造突变体，改造抗体是用 含四个重复拷贝的铰链区-CH2区的序列取代IgG重链的VH-CH1区获得。更优选的是源自 人的IgGl。
[0018] 优选地，所述乳头瘤病毒抗原蛋白的来源选自高危型的HPV16,18, 31，33, 35, 39， 45, 51，52, 56, 58, 59,68, 73,82 及 12 种低危型 HPV ;更优选高危型的 HPV16。
[0019] 优选地，所述人乳头瘤病毒的L2表位及通用型辅助性T淋巴细胞表位的串 联体，在所述串联体的上游融合有gp67信号肽序列；优选地，所述串联体是由来自 HPV16L2aa. 17-36 表位及 Th 表位（AAFIAAATLKAAA)，3 个 L2aa. 17-36 及 1 个通用型辅助 性T淋巴细胞表位依次串联，L2表位之间以GGP连接子连接，L2表位串与Th表位之间以 Xhol-Kpnl位点及GGP相连。
[0020] 所述串联体与IgG重链基因的突变体间以GGP连接子相连，所产生的表位抗原与 改造抗体融合蛋白具有SEQ ID N0 :2所不的氣基酸序列。
[0021] 本发明的第二方面涉及一种如第一方面所述的融合蛋白的编码核苷酸，优选地， 编码融合蛋白中乳头瘤病毒的抗原蛋白的核苷酸序列和编码改造抗体的核苷酸序列是彼 此独立的核苷酸序列并通过随后的相应的核苷酸编码序列的DNA重组技术进行拼接而获 得，优选地，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0022] 本发明的第三方面涉及一种包含第二方面所述的融合蛋白的编码核苷酸的 pFastBacl重组质粒，包含利用所述pFastBacl重组质粒构建的重组Bacmid，包含所述的重 组Bacmid的DHlOBac大肠杆菌，以及利用所述重组Bacmid构建的重组杆状病毒。
[0023] 本发明的第四方面涉及一种HPV预防性疫苗，本发明的HPV预防性疫苗的剂型可 以采取疫苗领域常见的所有剂型，例如肌肉注射剂型、皮下注射剂型、静脉注射剂型等。
[0024] 本发明的第五方面涉及如第一方面所述的融合蛋白、如第二方面所述的融合蛋白 的编码核苷酸、如第三方面所述的重组表达载体在制备用于预防HPV感染或者HPV感染相 关疾病的药物中的用途。
[0025] 综上，本发明以具有免疫佐剂活性的改造后的IgG重链为载体，构建融合HPV的L2 多表位及通用型Th表位抗原形式为基础的融合蛋白疫苗。用于HPV感染及HPV感染相关 疾病的免疫预防，具有重要经济及社会意义。 【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1、E3TR4融合蛋白的基因结构图，其中S代表gp67信号肽，E代表 HPV16L2aa. 17-36表位，T代表通用型Th表位，HCH2代表人IgGl铰链区及CH2结构域，Fc 代表人IgGl的Fc段，包括铰链区及CH2、CH3结构域。L2表位之间以GGP连接子连接，L2 表位串与Th表位之间以Xhol-Kpnl位点及GGP相连。
[0027] 图2、pFastBacl_E3TR4质粒图，显示其中插入了 E3TR4融合基因的重组质粒结构 简图。
[0028] 图3、显示了 E3TR4融合蛋白表达检测结果。A图代表细胞培养上清中表达E3TR4 融合蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果。B图代表细胞培养上清中表达E3TR4融合蛋白 的Western blot分析结果。
[0029] 图4、显示的是E3TR4免疫血清针对不同HPV型别假病毒的血清中和抗体滴度。其 中A图显示的是抗HPV16型中和抗体滴度，B图显示的是抗HPV18型中和抗体滴度，C图显 示的是抗HPV58型中和抗体滴度，D图显示的是抗HPV52型中和抗体滴度，E图显示的是抗 HPV5型中和抗体滴度。 【具体实施方式】
[0030] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不 背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0031] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均 可容易地从商业公司获取。
[0032] 实施例
[0033] 实施例1 :E3TR4融合基因的设计及优化
[0034] E3T基因的上游含有杆状病毒gp67信号肽序列，然后依次为经GGP连接子串联的 3个拷贝的HPV16L2aa. 17-36表位串、Xhol/Kpnl及GGP连接子序列及1个通用型Th表位 (SEQ ID NO :3 :AAFIAAATLKAAA)。R4基因的结构为4个拷贝的人IgGl铰链区及CH2结构 域（HCH2)串联子融合1个拷贝的IgGIFc段(包含铰链区及CH2、CH3结构域)。E3T抗原基 因与R4之间经GGP连接子连接，构成完整的E3TR4基因。经昆虫细胞偏性密码子优化获得 的E3TR4基因如SEQ ID N0:1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。E3TR4基因结构图 如图1所示。
[0035] 优化后获得的E3TR4基因序列由上海生工生物工程技术服务有限公司全基因合 成，并利用EcoRI及Hindlll酶切位点装入pFastBacl质粒，获得的重组质粒的图谱如图2 所示。
[0036] 实施例2 :E3TR4融合基因的重组Bacmid及重组杆状病毒的构建
[0037] 使用pFastBacl_E3TR4重组质粒转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，筛选获得重 组Bacmid，然后用重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，在Sf9内扩增重组杆状病毒。重组Bacmid 的筛选及重组杆状病毒的扩增方法都是公知的，参见例如专利CN101148661A。
[0038] 实施例3 :E3TR4融合蛋白基因在Sf9细胞中的表达
[0039] Sf9细胞接种重组杆状病毒进行E3TR4融合抗体的分泌表达，88h后收取培养上 清，3000rpm离心15min，收取上清，用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的，参见 例如专利 CN101148661A。
[0040] 实施例4 :E3TR4融合蛋白基因的表达鉴定及纯化
[0041] 取实施例3所述的培养上清80 μ 1，加入样品处理缓冲液，加热变性后进行10%的 SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色，具体方法是公开的，参见例如专利CN101148661A。
[0042] 取实施例3所述的昆虫细胞培养上清20 μ 1，加入样品处理缓冲液，加热变性后进 行10%SDS-PAGE电泳，转膜，封闭后使用1:3000稀释的HPV16L2aa. 17-36表位特异性单抗 RG-1作为一抗进行Western blot分析，具体方法是公开的，参见例如专利CN101148661A。 结果显示E3TR4基因有特异性蛋白表达，参见图3。大量收集培养上清，采用rProtein A S印harose FF亲和层析法进行纯化。首先用平衡液（lXPBS，5mM EDTA，pH6.8)平衡 rProtein A Sepharose FF亲和层析柱，然后240ml实施例3所述的昆虫细胞培养上清 经0. 45 μ m滤膜过滤后上样，流速为0. 3ml/min，上样完毕后用平衡液充分冲洗，然后用1M Arg，pH4. 0的洗脱液进行洗脱，分管收集洗脱液，用1M Tris-Cl，pH9. 0中和液调至中性。用 SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法鉴定洗脱液各个组分的纯度。取包含E3TR4目的条带的洗脱液 组分，合并后在PBS中4°C透析过夜，-80°C冻存。
[0043] 实施例5 :E3TR4融合蛋白广谱免疫活性的检测
[0044] 取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，随机分2组，每组5只。取约1. 7nmol的E3TR4及等 摩尔的E3多肽，调整体积至100 μ 1，然后与100 μ 1弗氏佐剂(第一次免疫使用完全弗氏佐 齐IJ，第2-4次免疫使用不完全弗氏佐剂）混匀乳化，于第0、14、28、42天分别皮下免疫小鼠。
[0045] 第56天尾静脉取血，分离血清。用假病毒中和实验测定针对不同型别的中和抗体 滴度，具体方法是公开的，参见例如Vaccine28 (2010) 3479 - 3487。
[0046] 结果如图4所示，E3TR4融合抗体加弗氏佐剂免疫除了能诱发针对HPV16的中和 抗体之外，还能诱发针对HPV5、18、58、52的交叉中和抗体，而E3多肽加弗氏佐剂免疫组则 检测不到针对上述5个型别的中和抗体。
[〇〇47] 上面结合说明书附图对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅是说明而非限定的 作用，本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上做出改进，但是不超过 本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所做出的改进都会落入本发明的保护范围。
[0001] 序列表 <11〇>屮N医学科学院甚础医学研究所 <120> L2多表位融合蛋白及其应爪 <130> 330067CG <160> 3 <170> Falenlln vei'sion 3. 1 <210> 1 <211> 2625 <2i2> DNA <213> 人了序列 <220 > <223> E3TR4融合蛋白的基因序列 <400> 1 algc taclcg 11aaccag?c Icaccaaggl llcaalaagg aacacaciag caagalggil 60 agcgctattg tcctgtatgi： gct.ct.t.ggca gctgcggccc attct-gcctt tgcgctcgag 120 caactctaca aaacatgcaa acaggcagga acatgcccac ctgacattat ccctaaggtc 180 ggoggaooto agttgtacan gficet.gnaa.g mggrtggomT.tgoortcf tgatatcate 240 cccaaggtcg gtggaccaca 8cttt.at.aag acatgtaaac aagcaggtac atgtccacca 300 gacatcattc ctaaagttct cgagggtacc ggc-ggtcccg ctgccttcat tgcagcigcc 360 actttgaaag ctgccgcagg aggccctgag cccaaatct.t ctgacaaaac tcacacaagc 420 ccaccaagcc cagcacclga acicctgggc ggaccalcag t.cltcctct t occcccaaaa 480 cccaaggaca ccctcatgat ct.ccaggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 540 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat 600 gccaagacaa agcctaggga ggagcagtac aacagcactt acagagtggt cagcgtcctc 660 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagt.aca agtgcaaggt ctccaacaaa 720 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggc-ggccc tgaacccaag 780
[0002]
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其包含乳头瘤病毒的抗原蛋白和改造的抗体蛋白序列，其中乳头瘤 病毒的抗原蛋白是人乳头瘤病毒的L2表位和通用性辅助性T淋巴细胞的串联体且在所述 串联体的上游融合有gp67信号肽序列，改造的抗体蛋白选自所有IgG亚型重链基因的改造 突变体，改造抗体是用含四个重复拷贝的铰链区-CH2区的序列取代IgG重链的VH-CH1区 获得，优选地，所述IgG亚型是人的IgGl，优选地，所述串联体与IgG重链基因的突变体间以 GGP连接子相连。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述乳头瘤病毒选自高危型HPV和低 危型 HPV，优选地，高危型 HPV 选自 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 及12 ;更优选地，高危型HPV是HPV16。
3. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于在所述串联体是由3个 HPV16L2aa. 17-36表位及一个通用型辅助性T淋巴细胞表位依次串联而获得，L2表位之间 以GGP连接子连接，L2表位串与Th表位之间以Xhol-Kpnl位点及GGP相连，优选地，所述 通用型辅助性T淋巴细胞表位的序列如SEQ ID NO :3所示。
4. 根据权利要求1至3任一项所述的融合蛋白，其特征在于在所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO :2 所示。
5. -种根据权利要求1至4任一项所述的融合蛋白的编码核苷酸，优选地，所述编码核 苷酸的序列如SEQ ID NO :1所示。
6. -种有效连接有权利要求5所述的编码核苷酸的pFastBacl重组质粒。
7. -种包含利用权利要求6所述pFastBacl重组质粒构建的重组Bacmid。
8. -种包含权利要求7所述的重组Bacmid的DHlOBac大肠杆菌。
9. 一种利用权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的编码核苷酸、权 利要求6所述的pFastBacl重组质粒、权利要求7所述的重组Bacmid或权利要求8所述的 DHlOBac大肠杆菌制备的HPV预防性疫苗。
10. -种权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的编码核苷酸、权利 要求6所述的pFastBacl重组质粒、权利要求7所述的重组Bacmid或权利要求8所述的 DHlOBac大肠杆菌在制备用于预防HPV感染或者HPV感染相关疾病的药物中的用途。
【文档编号】C12R1/19GK104059152SQ201310088091
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】许雪梅, 陈雪, 刘洪洋, 张婷, 谢喜秀 申请人:中国医学科学院基础医学研究所