一种蛋白酶k及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种蛋白酶K及其应用，所述的一种蛋白酶K的核苷酸序列为SEQ?ID?NO：2，氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1。本发明筛选出的蛋白酶K切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，可以用来制备脉冲电泳的染色体DNA,蛋白印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶，也可以用于提取组织中非蛋白成份降解含有蛋白质的杂志，比如DNA疫苗和肝素的制备等，具有工业生产应用价值。而且筛选出的蛋白酶K基因可以用来转化工程菌，从而获得具有表达蛋白酶K的重组菌。
【专利说明】-种蛋白酶K及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶基因工程【技术领域】，具体涉及一种蛋白酶Κ及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶 K(E. C. 3. 4. 21. 64)是真菌 Tritirachium album Limber 合成的胞外内肤 酶，它是具有典型催化三元组Asp39-His69-Ser 224的丝氨酸蛋白酶类中的一员。蛋白酶K具 有高于30U/mg的特异活性，是已知的内肽酶中最有活性的之一，并且非特异性水解天然的 和变性的蛋白质。
[0003] 成熟蛋白酶K由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结 构稳定。所以，与其他枯草杆菌蛋白酶相比，蛋白酶K对极端pH值、高温、离液剂和去污剂 具有高得多的稳定性，蛋白酶K在高温(达65°C)和宽pH范围（pH 7. 5 -12.0)具有高稳定 性。在变性剂例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性质使得蛋白酶K在要求非特异 性蛋白质降解的生物【技术领域】中具有很好的应用，特别是从粗提取液中分离核酸（DNA或 RNA)以及在DNA分析中预制备样品，另外蛋白酶K也可应用于蛋白质分析领域，例如结构释 析。
[0004] 但因为目前的Tritirachium album Limber基因的核苷酸序列不适合大规模发 酵，而且难以进行基因操作，之前曾进行过在其它宿主细胞中过量表达的重组蛋白酶K的 尝试，但存在着不表达、产生失活"包涵体"或者与复性有关的问题，在这些试验中没有检测 到显著活性。因此，需要对其序列进行相应的改造，以满足工业生产的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种蛋白酶K及其应用，即一种具有工业应用价值的新型蛋 白酶K，以弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明一个方面涉及一种蛋白酶K，包括有：
[0007] a)序列为 SEQ ID N0 :1 的酶；
[0008] b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述 酶的活性的，由a衍生的酶。
[0009] 编码上述蛋白酶K的核苷酸，其优化的序列为SEQ ID N0 :2。
[0010] 本发明还提供用于表达上述蛋白酶K的重组表达质粒，是将序列为SEQ ID NO ：2 的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
[0011] 本发明还涉及携带有表达上述蛋白酶κ的重组表达质粒的重组菌。
[0012] 本发明筛选出的蛋白酶K能切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，可以 用来制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶，也可以用 于提取组织中非蛋白成份降解含有蛋白质的杂志，比如DNA疫苗和肝素的制备等，具有工 业生产应用价值。而且筛选出的蛋白酶K基因可以用来转化工程菌，从而获得具有表达蛋 白酶K的重组菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1 :本发明的蛋白酶K在黑曲霉宿王中的pH稳定性；
[0014] 图2 :本发明的蛋白酶K在黑曲霉宿主中的温度稳定性。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下 列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0016] 1、蛋白酶K基因的合成
[0017] 将Tritirachium album Limber的序列进行改造，形成新的核酸序列ProK，使 ProK不被Xho I和Xba I两个酶切位点切断，获得的新的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0: 2,其编码的蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。在ProK序列两端加 Xho I和Xba I酶 切位点，将文本序列送至生物公司（上海生工)合成，合成的ProK被连接在载体PSG-TS上， 插入位点为t-a克隆，受体菌为大肠杆菌DH5 α菌株。
[0018] 2、蛋白酶Κ基因重组载体的构建
[0019] 将连在PSG-TS载体上的ProK基因用Xho I和Xba I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳， 切胶回收酶切产物片段，与同样用Xho I和Xba I双酶切并切胶回收的质粒pGm连接，转化 感受态大肠杆菌（E. coli)DH5a后，涂于含有Amp的LB固体培养基上。37°C培养14-16小 时，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到4 ml LB液体培养基中进行培养 (含Amp)，培养14-16小时后，提取质粒，将重组质粒pGm-Pr〇K转入表达宿主黑曲霉G1，含 有该重组质粒的重组菌株命名为Gl-pGm-ProK。
[0020] 其中的酶切及连接反应均参照表1。
[0021]
【权利要求】
1. 一种蛋白酶K，包括有： a) 序列为SEQ ID NO :1的酶； b) 在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2. -种编码权利要求1所述的蛋白酶K的核苷酸，其序列为SEQ ID NO :2。
3. -种重组表达质粒，所述的重组表达质粒用于表达权利要求1所述的蛋 白酶K。
4. 如权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于所述的重组表达质粒是 将序列为SEQ ID NO :2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
5. -种重组菌，所述的重组菌携带有权利要求3所述的重组表达质粒。
【文档编号】C12N15/57GK104059900SQ201310088128
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】王华明, 林艳梅 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所