5亚型Na⁺/H⁺交换泵(NHE5)抑制剂在改善记忆保持(memoryretention)中的用途的制作方法

专利名称：：5亚型Na⁺/H⁺交换泵(NHE5)抑制剂在改善记忆保持(memoryretention)中的用途的制作方法5亚型Na+ZH+交换泵(NHE5)抑制剂在改善记忆保持(memoryretention)中的用途本发明涉及5亚型Na+/H+交换泵(NHE5)抑制剂在生产用于治疗神经变性病症、记忆缺陷和痴呆性病症(dementingdisorders)以及用于改善记忆的药物中的用途。术语"痴呆，，指智力能力下降。应理解特别指记忆和思维能力下降。老年人中的痴呆或老年性痴呆指老年人的进行性、获得性智力下降，其可归因于中枢神经系统的结构和/或代谢异常。在65岁以上的人群中有约7%的人患有不同严重程度的痴呆。痴呆的原因是不同的阿尔茨海默病是最常见的形式，占至多50%，随后是血管性痴呆，例如多发性脑梗塞痴呆，和这两种形式的组合。非常罕见的原因是Tau突变、朊病毒病、聚谷氨酰胺扩展性障碍(polyglutamineexpansiondisorder)如亨廷顿舞蹈病和脊號小脑性共济失调以及帕金森综合征。另外还已知的是在感染(例如HIV感染)、脑外伤、脑肿瘤或中毒(例如酒精中毒)后和/或与之相关的继发性痴呆。记忆巩固(memoryconsolidation)的概念是基于新记忆随时间过程稳定并由此变得对新信息的干扰和脑功能障碍的敏感性降低的能力。借助流行的长时程增强(LTP)细胞模型，能够研究记忆形成和巩固的基本方面和机制(iV缀0sdew組9z463-474.2003j5mi'"及m5m/"及es及ev.45:30-37,2004;尸/i"iW及ev.84:87-136，2004)。储存和加工信息的最重要脑区域之一为海马结构。长久以来已经知晓在海马中的某些模式的电刺激(促强直)导致突触效能改变(Bliss和Lomo，//V^wV/.232:331-356，1973)，其目前称为"长时程增强"或"LTP"并随后已经在各种哺乳动物的脑的其它区域在体外和体内均得以证实。LTP目前被视为学习和记忆的神经机制的重要组成。还已知弱的LTP与短期记忆相关，而强的LTP与长期记忆相关(/7Vew^"20:7631-7639，2000;1VvcA^/^cw/Sc/C/SA97:8116-8121，2000)。海马在情景、空间和陈述性学习和记忆过程中起重要作用，这对于空间定位和回忆空间结构而言是必要的，并且在控制自律机能和营养机能中起重要作用(McEwen1999，"应激和海马可塑性"0^i^s/;/flWZc刚，j/t聽a/及eW，o/iVewas"'ewce22:105-122)。在人痴呆性病症中，通常有其中牵涉海马的学习和记忆过程受损。对其它哺乳动物进行的动物实验已经显示了类似的结果。因此，能够证实，老龄小鼠与青年小鼠相比在空间记忆和LTP中存在缺失，并且改善LTP的物质同时减轻了记忆缺失(Bach等人，1999，"年龄相关性空间记忆缺失在体外与海马长时程增强晚期的缺陷相关，并且被增强cAMP信号传导途径的药物减弱"04ge-"/fl紐dJe/"fe/"c^MPs/gwa/Z/ig/^/iM^v).P/wA^,/爿oi""'f/Sj.27;96:5280-5;Fujii&Sumikawa2001，"急性和长期接触尼古丁可逆转大鼠海马长时程增强诱导中的年龄相关性下降，，(Jc"feflw</c/ffow/cd/os"re"vm^flge-"/",erf/"幼e/她wft'a,/ort/m幼emf/j,;p/^ai附/m"，5ra/w及"894:347-53，Clayton等人，2002,"海马NR2B缺陷能模拟Fischer344大鼠的长时程增强和空间学习的年龄相关性变化"(j3628-37)。能够在转基因动物上和通过施用p-淀粉样肽在体内和体外证实这些肽不利地影响LTP或者干扰其维持(Ye&Qiao1999,"在大鼠海马中通过卩-淀粉样肽片段31-35所产生的对长时程增强的抑制性活性是N-甲基-D-天门冬氨酸受体依赖性的其通过(-)石杉碱甲抵消"Oywp/;rMwVe,Tim《/r,》"cfl附/7"51〃-廳勿/-1)-<^^她"c印^-/"fife/;ewflfewA.約o加"f^/i"/^rz/"e爿)，iVe"myc/JLe汰275:187-90;Rowan等人,2003，"早期阿尔茨海默病动物模型中的突触可塑性"OS^"印"c//flWc/印/"ttm'附ff/wo^/s0/eflr(j;爿/z/re/附C51f/i'5^cwe),尸AZ/os7Vyww5WcZ^wrf忍5/o/5"cA358:821-8;Gureviciene等人，2004，"APP+PS1转基因小鼠中LTP的正常i秀导但加速的衰退，，(7Vof附tf//"^W朋6m^tfcce/eni^flfeoi^o/￡77*,Vi爿PP+尸57fr朋sgew/c附/ce)，NewroWo/D/s15:188-95)。有可能用唂利普兰和胆碱酯酶抑制剂如也用于人阿尔茨海默病治疗中的那些来校正LTP受损和记忆功能受损(Gong等人，2004，"在阿尔茨海默病小鼠模型中用咯利普兰治疗后突触功負fe和i人知功肯fe的7^C久'i"生改善"(/^rsiytew/iVw/jroveiwew/^""/^ccogw/"ve/"wCV/isi"朋/4/z/r".舰,附o附c附0&/a/ter/—附fm^附c"0,/C""/"舰114:1624-34.)。由此预计，改善LTP的物质将对与认知缺损和痴呆相关的病症也具有有益作用。已经令人意外地发现，细胞NHE5抑制剂可提高LTP。因此，预期该抑制剂在痴呆性病症如阿尔茨海默形式和阿尔茨海默样形式的痴呆中有改善记忆的作用。使用NHE5抑制剂所具有的优点超过迄今为止用于这些病症的活性成分如乙酰胆碱酯酶抑制剂，即，预计全身作用轻微或不存在，因为NHE5仅在神经元中表达且因此是脑特异性的(Jw./.CW/.脚嵐281:C1146-C1157，2001)。因此，NHE5抑制剂适于治疗神经变性病症、记忆缺陷和痴呆性病症，例如在老年人中的痴呆、阿尔茨海默病、血管性痴呆如多发性脑梗塞痴呆、阿尔茨海默病与脑血管紊乱的组合、Tau突变、朊病毒病、聚谷氨酰胺扩展性障碍如亨廷顿舞蹈病和脊髓小脑性共济失调以及帕金森综合征；以及适于改善记忆。NHE5抑制剂还适于治疗在感染如HIV感染、脑外伤、脑肿瘤或中毒如酒精中毒后和/或与之相关的继发性痴呆。特别适于治疗神经变性病症、记忆缺陷和痴呆性病症和适于改善记忆的是具有式I结构的如下NHE5抑制剂及其可药用盐和三氟乙酸盐其中各含义为Rl、R2、R3和R4彼此独立地为氢、F、Cl、Br、I、CN、N02或Rll-(CmH^)-An-;m为0、1、2、3或4;n为0或1;Rll为氢、曱基或CpF2pw;A为氧、NH、N(CH3)或S(O)q;p为1、2或3;q为0、1或2;R5为氢，具有l、2、3、4、5或6个碳原子的烷基，或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；R6为氢；OH;F;CF3;具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；R7和R8彼此独立地为氬、F、Cl、Br、CN、C02R12、NR13R14或Rl6-(CmmH2mm)-Enn_;R12为氢；具有l、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；R13和R14彼此独立地为氢；具有l、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；或者R13和R14与它们所键合的氮原子一起形成4-、5-、6-或7-元环，其中一个CH2基团可以被NR15、S或氧替换；R15为氢；具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；mm为0、1、2、3或4;im为0或ljR16为氢、甲基或CppF2pp+1;E为氧或S(O)qq;pp为1、2或3'，qq为0、1或2。在一项实施方案中，优选如下定义的式I化合物及其可药用盐和三氟乙酸盐，其中各含义为Rl、R2、R3和R4彼此独立地为氢、F、Cl、Br、CN或Rll-(CmH2m)-An-;m为0或1;n为0或1;Rll为氢、甲基或CpF2p^;A为氧、NCBb或S(O)q;p为1或2;q为0、1或2;R5为氢、曱基、乙基或环丙基；R6为氢或甲基；R7和R8彼此独立地为氬、F、Cl、CN、C02R12、NR13R14或R16匪(CmmH2mm)-E加-;R12为氢、甲基或乙基；R13和R14彼此独立地为氢；具有l、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；或者R13和R14与它们所键合的氮原子一起形成5-、6-或7-元环，其中一个CH2基团可以被NR15、S或氧替换；R15为氢；具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；mm为0、1或2;nn为0或1;R16为氢、甲基或CppF2pp+1;E为氧或S(O)qq;pp为1或2;qq为0、1或2。特别优选如下定义的式I化合物及其可药用盐和三氟乙酸盐，其中R1和R3为氢；R2和R4彼此独立地为氢、F、Cl、NH2、NHCH3或N(CH3)2;R5为氢、甲基、乙基或环丙基；R6为氢或甲基；R7和R8为氢。具体优选N-二氨基亚甲基-4-(6，8-二氯-2-甲基-1，2，3,4-四氢异喹啉-4-基)苯磺酰胺及其可药用盐和三氟乙酸盐。在一项实施方案中，优选如下定义的式I化合物其中基团R1、R2、R3和R4被各自独立地描述为氢、F、Cl、Br、CN或Rll-(CmH2m)-An-，其中m和n彼此独立地为0或1，Rll为氢、甲基或CpF2pw，且A为氧、NCH3或S(0)q，其中p为l或2且q为0、1或2;特别优选如下定义的式I化合物其中R1和R3为氢，且R2和R4彼此独立地为氬、F、Cl、NH2、NHCH3或N(CBb)2，例如Cl。在一项实施方案中，优选如下定义的式I化合物其中R2和R4不为氩。在另一项实施方案中，优选如下定义的式I化合物其中R5被描述为氢、曱基、乙基或环丙基，例如曱基。在另一项实施方案中，优选如下定义的式I化合物其中R6被描迷为氢或甲基。在另一项实施方案中，优选如下定义的式I化合物其中基团R7和R8净皮各自独立地描述为氲、F、Cl、CN、C02R12、NR13R14或R16-(CmmH2mm)-Enn-，其中R12为氢、曱基或乙基，R13和R14彼此独立地为氢，具有l、2、3或4个碳原子的烷基，或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；或者R13和R14与它们所键合的氮原子一起形成5-、6-或7-元环，其中一个CH2基团可以被NR15、S或氧替换，且其中R15为氢，具有l、2、3或4个碳原子的烷基，或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；且其中mm为0、1或2,nn为0或1，且R16为氢、甲基或CppF2pp+1，其中E为氧或S(O)qq，其中pp为1或2且qq为0、1或2;特别优选如下定义的式I化合物其中R7和R8为氢。如果式I化合物包含一个或多个不对称中心，那么它们可以彼此独立地具有S和R构型。这些化合物可以是旋光异构体、非对映异构体、外消旋物或其所有比例的混合物的形式。本发明嚢括式I化合物的所有可能的互变异构形式。本发明还嚢括式I化合物的衍生物，例如式I化合物的溶剂化物(如水合物和醇加合物)、酯类、前药和其它生理学上可接受的衍生物，以及式I化合物的活性代谢物。本发明同样嚢括式I化合物的所有晶体变体(crystalmodifications)。烷基可以为直链或支链的。当它们带有取代基或作为其它基团的取代基(例如在氟烷基或烷氧基中)出现时，这种情况也适用。烷基的实例有曱基、乙基、正丙基、异丙基(-l-曱基乙基)、正丁基、异丁基(=2-甲基丙基)、仲丁基(=1-曱基丙基)、叔丁基(-l，l-二曱基乙基)、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基和己基。优选的烷基有曱基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。烷基中有一个或多个、例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氢原子可以被氟原子替换。这类氟烷基的实例有三氟甲基、2，2，2画三氟乙基、五氟乙基、七氟异丙基。取代的烷基可以在任意位置上被取代。亚烷基如CmH2m、C匪Hb,或CrEbr可以为直链或支链的。当它们带有取代基或作为其它基团的取代基(例如在氟亚烷基中，例如在CpF2p和CppF2pp中)出现时，这种情况也适用。亚烷基的实例有亚甲基、亚乙基、1-甲基亚甲基、亚丙基、1-甲基亚乙基、亚丁基、1-丙基亚曱基、l-乙基-l-曱基亚甲基、1，2-二甲基亚乙基、l，l-二曱基亚甲基、1-乙基亚乙基、1-甲基亚丙基、2-甲基亚丙基、亚戊基、1-丁基亚甲基、1-丙基亚乙基、1-甲基-2-乙基亚乙基、1，2-二甲基亚丙基、1,3-二甲基亚丙基、2,2-二甲基亚丙基、亚己基和l-曱基亚戊基。亚烷基中有一个或多个、例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氢原子可以被氟原子替换。取代的亚烷基可以在任意位置上被取代。亚烷基中有一个或多个CH2基团可以被氧、S、NH、N-烷基或N-环烷基替换。环烷基的实例有环丙基、环丁基、环戊基或环己基。环烷基中有一个或多个、例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氢原子可以3皮氟原子替换。取代的环烷基可以在任意位置上被取代。环烷基还可以是支链形式的，如作为烷基环烷基或环烷基烷基、例如曱基环己基或环己基甲基存在。衍生自其中R13和R14与它们所键合的氮原子形成4-、5-、6-或7-元环、其中一个CH2基团可以被NR15、S或氧替换的NR13R14的环的实例有吗啉、吡咯烷、旅，定、哌溱和N-曱基哌，秦。如果变量作为组成部分出现一次以上，那么变量的定义每次出现时彼此独立。如果式I化合物包含一个或多个酸性或碱性基团或者一个或多个碱性杂环，那么相应的生理学上或毒理学上可接受的盐也属于本发明的范围，尤其是可药用盐。因而，式I化合物可以在酸性基团上被脱质子化，并且例如以碱金属盐、优选钠盐或钾盐的形式使用，或者以铵盐如与氨或有机胺或氨基酸形成的盐的形式使用。由于式I化合物始终包含至少一个碱性基团，所以它们也可以以生理学上可耐受的酸加成盐的形式来制备，例如与下述酸形成的那些无机酸，例如盐酸、硫酸或磷酸；或有机酸，例如乙酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙二酸、曱磺酸、富马酸。在本文中适宜的酸加成盐是与所有药理学上可接受的酸形成的盐，例如自化物，特别是盐酸盐、乳酸盐、疏酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、磷酸盐、曱基磺酸盐、对曱苯磺酸盐、己二酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、马来酸盐和朴酸盐(该基团还相应于生理学上可接受的阴离子);还有三氟乙酸盐。本文所述的式I化合物可以如下制备通过熟练技术人员已知的方法使式VIII化合物氯磺化，随后通过熟练技术人员已知的方法与胍反应(例如如iS"狄"/cC麵/w謹Vfffto叫33(7)，1073;2003中所述)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>没有必要分离在氯磺化后所得的式XII中间体，但是可以直接与胍进行进一步反应。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>式VIII的原料化合物可以如下制备通过使式VI化合物中的羰基部分还原、例如用硼氢化钠还原且随后使所得的式VII醇进行酸-或碱-催化环化(参见rwm/^^wi丄e汰1989，30，5837;Org./Vocerf./"t1995，27，513)，能够通过熟练技术人员已知的方法制备式VIIIa的四氢异壹啉类，其中Rl-R8具有上文所述的含义。VUIa其中R6不为氢的式I的烷基-支链的化合物可以如下制备通过已知方法使相应的式IX的二苯基乙酸酯在ot位被R6烷基化。式X化合物可以通过标准方法转化为相应的式XI酰胺，式XI酰胺在类似皮克特-施彭格勒(Pictet-Spengler)的反应中转化为所需的式VIIIb的四氢异会啉类(参见r"ra/i^/iwi1987,43，439;Ore附.i^"r抓5"//.1985，33，340),其中Rl-R8如上文所定义，且LG相当于通常用于烷基化的离去基团，例如溴、氯、曱笨磺酸酯基或甲磺酸酯基。千胺和由适当的式V的氨基取代的oc-溴乙酰苯化合物来制备，其中Rl-R8如上文所定义。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式V的a-溴乙酰苯化合物可以按照文献方法由相应的乙酰苯前体通过溴化来获得。如果式IV的节胺前体不能通过购买获得，则可以通过熟练技术人员已知的标准方法由相应的式III的节基卣化物如爷基氯或节基溴和由相应的胺类R5-NH2来合成，其中Rl-R5如上文所定义，且X为F、Cl、Br或I,特别是Cl或Br。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>或者，式IV化合物还可以通过熟练技术人员已知的标准方法、通过式Ilia的醛进行还原性胺化反应来获得，其中Rl-R5如上文所定义。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式III和IIIa、IX和R6-LG和R5-NH2的化合物可以通过购买获得，或者通过常规方法对产物和/或中间体进行后处理，且如果需要的话进行纯化，所述方法例如有萃取、色镨法或结晶和常规干燥。本发明涉及式I化合物及其可药用盐在生产药物中的用途，所述药物用于治疗神经变性病症、记忆缺陷和痴呆性病症，例如在老年人中的痴呆、阿尔茨海默病、血管性痴呆如多发性脑梗塞痴呆、阿尔茨海默病与脑血管紊乱的组合、Tau突变、朊病毒病、聚谷氨酰胺扩展性障碍如亨廷顿舞蹈病和脊髓小脑性共济失调以及帕金森综合征；以及适于改善记忆。NHE5抑制剂还适于治疗在感染如HIV感染、脑外伤、脑肿瘤或中毒如酒精中毒后和/或与之相关的继发性痴呆。本发明还涉及包含有效量的式I化合物和/或其可药用盐的人用或兽用药物，并且还涉及包含有效量的单独的或与一种或多种其它具有药理活性的成分或药物组合的式I化合物和/或其可药用盐的人用或兽用药物。包含式I化合物或其可药用盐的药物例如可以通过口服、胃肠道外、肌内、静脉内、经直肠、经鼻、经吸入、皮下或通过适宜的经皮剂型来施用，优选的施用取决于病症的具体表现。此外，式I化合物可以单独使用或者与药用赋形剂一起使用，特别是在兽用和人用药中如此。药物包含其量通常为0.01mg-lg/剂量单位的式I和/或其可药用盐的活性成分。根据其专业知识，熟练技术人员熟知哪些赋形剂适于所需的药物制剂。除了溶剂、凝胶成形剂(gdformers)、栓剂基质、片剂赋形剂和其它活性成分载体以外，还可以使用例如抗氧化剂、分歉剂、乳化剂、消泡剂、掩味矫味剂、防腐剂、增溶剂或着色剂。就口服使用的剂型而言，将活性化合物与适于该目的的添加剂如栽体、稳定剂或惰性稀释剂混合，通过常规方法转化为适宜的剂型如片剂、包衣片、两节套合式胶嚢、水性溶液、醇性溶液或油性溶液。可以使用的惰性载体的实例有阿拉伯树胶、氧化镁、碳酸镁、磷酸钾、乳糖、葡萄糖或淀粉，尤其是玉米淀粉。制备可以采取干颗粒形式或湿颗粒形式进行。适宜的油性载体或溶剂的实例有植物油或动物油，例如葵花油或鱼肝油。就皮下、经皮或静脉内施用而言，将所用的活性化合物转化成溶液、混悬液或乳剂，如果需要的话，与常用于该目的物质如增溶剂、乳化剂或其它赋形剂一起转化为溶液、混悬液或乳剂。适宜溶剂的实例有水、生理盐水溶液或醇类(如乙醇、丙醇、甘油)以及糖溶液(如葡萄糖或甘露醇溶液)，以及所提及不同溶剂的混合物。适于以气溶胶或喷雾剂形式施用的药物制剂例如有式I活性成分在可药用溶剂、例如特别是乙醇或水或这类溶剂的混合物中的溶液、混悬液或乳剂。如果需要的话，制剂还可以包含其它药用赋形剂，例如表面活性剂、乳化剂和稳定剂以及抛射剂气体。这类制剂通常包含浓度为约0.1-10%、特别是约0.3-3%重量的活性成分。所施用的式I活性成分的剂量与施用频率取决于所用化合物的作用功效和持续时间；另外，还取决于所治疗疾病的性质和严重性，取决于所治疗哺乳动物的性别、年龄、体重和个体响应。平均而言，对体重约为75kg的患者而言，式I化合物的日剂量至少为0.001mg/kg、优选0.1mg/kg、至多30mg/kg、优选lmg/kg体重，在急性情况下，例如在高海拔时呼吸暂停状态后的即刻，甚至更高的剂量可能也是必要的。直达300mg/kg/天可能是必要的，尤其是对于静脉内使用而言，例如对重症监护病房的梗塞患者的静脉内使用而言。日剂量可以分为一次或多次、例如至多4次单剂量。实验描述和实施例所用缩略语名单AMPA可被a-氨基-3-羟基-5-曱基异喝唑-4-丙酸酯激活的受体偶联通道CA1CA-海马角(阿蒙角)，海马中的CA1区EA乙酸乙酯EPSP兴奋性突触后电位ES+电喷雾HEP正庚烷ConcNH3饱和NH3水溶液LTP长时程增强LTP1早期LTP(LTP的阶段)MeOH曱醇mp溶点MS质镨法NMDA可被N-甲基-D-天冬氨酸激活的受体偶联通道RT室温STP短时程增强(LTP的阶段)THF四氢吹喃实施例1:N-二氨基亚甲基-4-(6，8-二氯-2-甲基-l，2，3，4-四氢异壹啉-4-基)苯磺酰胺二盐酸盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在氩气环境中，将0,36g胍混悬于30ml无水THF中，加入0.40g4-(6，8-二氯-2-甲基-l，2，3，4-四氢异壹啉-4-基)苯磺酰氯(W02003048129)。将混合物在RT下搅拌24小时，然后蒸馏出THF。将10ml水加入到残余物中，过滤出沉淀。用10ml水洗涤，在真空中干燥。然后将固体混悬于10mlEA中，加入10mlHCl在乙醚中的饱和溶液。在真空中除去挥发性成分，将残余物混悬于10mlEA中，在RT下搅拌5小时。然后过滤出沉淀，在真空中干燥。获得0.45g，mpl40。C(分解)。Rf(EA/HEP/CH2Cl2/MeOH/浓NH3=10:5:5:5:1)=0.30MS(ES+):412药理学数据NHE5试.睑描述在本试验中，测定LAP1细胞的胞内pH(pHi)在酸化后的恢复，其中LAP1细胞稳定表达钠-质子交换泵(NHE)的不同亚型。在起作用的NHE的情况下，这一恢复甚至在不含碳酸氢根的条件下开始。为此目的，使用pH-敏感性荧光染料BCECF(分子探针(MolecularProbes)公司，Eugene,OR,USA;使用前体BCECF-AM)测定pHi。首先将细胞与BCECF(5|nMBCECF-AM)在NH4C1緩冲液(NBUC1緩冲液115mM盐酸胆碱，20mMNH4C1，5mMKC1，ImMCaCl2，ImMMgCl2，20mMHepes，5mM葡萄糖;使用IMKOH建立pH为7.4)中孵育。通过将在NH4C1緩冲液中孵育的细胞用不含NH4C1的緩冲液(133.8mM盐酸胆碱，4.7mMKCl，1.25mMCaCl2，1.25mMMgCl2，0.97mMK2HP04，0.23mMKH2P04，5mMHepes,5mM葡萄糖；使用1MKOH建立pH为7.4)洗涂，从而诱导细胞内酸化。在洗涤操作后，使90u1不含NH4C1的緩沖液保留在细胞上。在分析仪器(FLIPR，"荧光成像板读数器"，分子装置(MolecularDevices)公司，Sunnyvale,Ca.，USA)中通过添加卯pl含Na+的緩沖液(133.8mMNaCl,4.7mMKC1，1.25mMCaCl2，1.25mMMgCl2，0.97mMNa2HP04，0.23mMNaH2P04，10mMHepes，5mM-葡萄糖；使用1MNaOH建立pH为7.4)启动pH恢复。在498nm的激发波长和FLIPR发射滤波器1(带隙510-570nm)处测定BCECF荧光。针对NHE5记录随后的荧光变化达2分钟作为pH恢复的测量值。对于计算测试物质的NHE-抑制潜能，首先将细胞在发生pH完全恢复或根本没有任何恢复的緩冲液中进行测试。对于pH完全恢复(100。/。)而言，将细胞在含Na+的緩沖液(参见上文)和不含Na+的緩沖液中孵育以测定0%值(参见上文)。将测试物质在含Na+的緩冲液中配制。将物质的每一测试浓度下的细胞内pH恢复以占最大恢复的百分数表示。通过XLFit程序(药物发现软件(idbs)，萨里，UK)由pH恢复百分数计算具体物质对各NHE亚型的IC5。值。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>测试描述海马切片长期试验(体外)实验手段CA1区中的LTP为在体外已经最佳表征的LTP。该区的分层和输入结构允许在体外历经数小时进行场电位测定。在NHE研究中，使用基于e节律并诱导早期LTP(其在3小时内回复到初始值)的弱强直o/A^"r仍"e"ce，18(16)，6071(1998);五w/尸/r"r附tfc^/.502:99-104，2004)。近来已经证实，e发作性训练的数目增加诱导了强度和持久性增加的PLT(/7Ve"r印/^wW.88:249-255,2002)，即，单一弱刺激诱导了不饱和的LTP,而非最大可获得的饱和类型的LTP。这种LTP的强度(Behnisch，Reymann等人，A/ewwc/.Ze汰1998，253(2):91-94)和持久性(例如A^"r0/i印ftW^26:421-427，1994)可通过物质改善或受其不利的影响。在我们的研究中所产生的早期LTP同样是不饱和的。因此，能够确定物质诱导的早期LTP改善或恶化。所研究的早期LTP由已知持续约30分钟的STP組件(AWwe335:820-824，1988)和通常在LTP诱导后前1-2小时内持续的LTPl组件(丄^mM^/w.3:1-24，1996)所组成。强直前初始值的短期(30-60分钟)记录允许所研究物质对所研究的正常未受刺激的突触传递的早期作用。由于主要的兴奋性突触为谷氨酸能的(JC7/"iVewo/^"/^.9:252-263，1992)，即，单突触场EPSP非常主要地通过AMPA和仅仅以相当低的程度通过NMDA受体进行测定，所以同时间接地测试了对谷氨酸能传递的作用。方法海马切片长期试验(体外)动物类型年龄7-8周龄品系威斯特(Wistar)(ShoeWist，Shoe)性别雄性繁殖者海伦'温克尔曼(HarlanWinkelmann)股份有限公司，人工光(6-18.00h)和每日昼夜节律准备震晕用铁棒击打在颈后部上处死断头术暴露脑通过沿颅骨矢状缝由背侧至腹侧切开，从而开放头盖骨。暴露海马将脑在半球之间切开，采用右半球为原料，使用钝器拉出海马。切片的制备将暴露的海马转入具有湿滤纸的冷却块，借助另一片滤紙吸出过量的水份。将按照这种方式固定在冷却块上的海马放在切物机上，沿水平方向旋转至海马与切片刀成适当角度。切割角度为了维持海马的片状结构，有必要以相对于切片刀(切物机)约70度的角度将海马切片。切片以400|iini间隔将海马切片。借助极软的、充分湿润的刷子(貂毛)从刀片上取下切片，转入具有充入95%02/5%C02的冷却营养液的玻璃容器中。总制备持续时间不超过5分钟。切片的储存浸渍切片切片在温控室(33。C)内位于液面下l-3mm。流速为2.5ml/min。在预热室内在轻微升高的压力(约latm)下和通过显微操作针进行预先气体处理。使切片室与预热室连接，以便能够维持微循环。通过95%02/5%C02通过显微操作针流出来启动微循环。切片适应使新鲜制备的海马切片在切片室内于33'C适应至少1小时。测试刺激物水平的测定刺激物7K平fEPSP:30。/o的最大EPSP病灶电位的测定刺激将单极刺激电极用于局部刺激谢弗侧枝(Schaffercollateral)(电压l-5V，一个极性脉冲宽度为O.lms，总脉冲0.2ms),所述电极包括涂漆的不锈钢和恒流电双相刺激发生器(WPIA365)。测定将充入有正常营养液的玻璃电极(具有纤丝的硼硅玻璃，l-5MOhm，直径1.5mm,顶圆直径3-20nm)用于记录来自辐射层的兴奋性突触后电位(fEPSP)。采用DC电压》文大器，相对于位于切片室边缘的氯化银参比电极测定场电位。通过低通滤波器(5kHz)过滤场电位。场电位的测定测定fEPSP的斜率(fEPSP斜率)用于实验的统计分析。借助神经生理学部门研发的软件程序(PWIN)进行实验的记录、分析和控制。借助Excel软件在各时间点进行平均fEPSP斜率的形成和构建图，并适当宏观地进行自动数据记录。营养培养基(林格溶液):<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>将实施例1溶于DMSO中，用林格溶液稀释至实验的终浓度(终浓度0.01%DMSO)。实验概要在对照实验中，在开始时记录基线突触传递达60-120分钟。随后，以200ms间隔给予两个双脉沖4次，其中双脉冲的脉冲间隔为10ms，且单个脉冲的宽度为0.2ms(弱强直)。记录所得EPSP增强达至少60分钟。在测试NHE5抑制剂作用的实验中，再次在开始时记录基线达60-120分钟。在刺激前20分钟充入NHE5抑制剂(10pM)。以200ms间隔给予两个双脉沖4次作为对照实验，其中双脉冲的脉沖间隔为10ms，且单个脉冲的宽度为0,2ms。在刺激后洗涤掉物质达20分钟，记录EPSP增强达至少60分钟。结果实施例1的化合物在所用的浓度对突触传递没有固有(intrinsic)作用。施用实施例1后的增强在刺激后80分钟时仍然在基线的137%下，而在对照条件下的增强几乎恢复到基线水平，为基线的113%。这清楚地表明，甚至是10nM的实施例1的化合物也改善了弱LTP的维持。权利要求1.式I化合物及其可药用盐在生产用于治疗神经变性病症、记忆缺陷和痴呆性病症以及用于改善记忆的药物中的用途，其中各含义为R1、R2、R3和R4彼此独立地为氢、F、Cl、Br、I、CN、NO2或R11-(CmH2m)-An-；m为0、1、2、3或4；n为0或1；R11为氢、甲基或CpF2p+1；A为氧、NH、N(CH3)或S(O)q；p为1、2或3；q为0、1或2；R5为氢，具有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基，或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；R6为氢；OH；F；CF3；具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；R7和R8彼此独立地为氢、F、Cl、Br、CN、CO2R12、NR13R14或R16-(CmmH2mm)-Enn-；R12为氢；具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；R13和R14彼此独立地为氢；具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；或者R13和R14与它们所键合的氮原子一起形成4-、5-、6-或7-元环，其中一个CH2基团可以被NR15、S或氧替换；R15为氢；具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；mm为0、1、2、3或4；nn为0或1；R16为氢、甲基或CppF2pp+1；E为氧或S(O)qq；pp为1、2或3；qq为0、1或2。2.如权利要求1中所要求的用途，其中使用式I化合物及其可药用盐，其中各含义为Rl、R2、R3和R4彼此独立地为氩、F、Cl、Br、CN或Rll-(CraH2m)-An-;m为0或1;n为0或1;Rll为氢、甲基或CpF2p+j;A为氧、NCBb或S(O)q;p为1或2;q为0、1或2;R5为氢、甲基、乙基或环丙基；R6为氢或曱基；R7和R8彼此独立地为氢、F、Cl、CN、C02R12、NR13R14或Rl6-(CmmH2mm)-Enn_;R12为氬、甲基或乙基；R13和R14彼此独立地为氬；具有l、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；或者R13和R14与它们所键合的氮原子一起形成5-、6-或7-元环，其中一个CH2基团可以被NR15、S或氧替换；R15为氢；具有1、2、3或4个碳原子的烷基；或具有3、4、5或6个碳原子的环烷基；mm为0、1或2;im为0或ljR16为氢、甲基或CppF2pp+1;E为氧或S(O)qq;pp为1或2)qq为0、1或2。3.如权利要求1或2中所要求的用途用盐，其中各含义为Rl和R3为氢；R2和R4彼此独立地为氢、F、Cl、NH2、R5为氢、甲基、乙基或环丙基；R6为氢或甲基；R7和R8为氢。4.如权利要求l-3中一项或多项所要求的用途，其中使用N-二氨基亚甲基-4-(6，8-二氯-2-甲基-l，2，3，4-四氩-异会啉-4-基)苯磺酰胺或其可药用盐。5.如权利要求1-4中一项或多项所要求的用途，用于生产治疗痴呆性病症的药物。6.如权利要求l-5中一项或多项所要求的用途，用于生产治疗老年人中的痴呆的药物。7.如权利要求1-4中一项或多项所要求的用途，用于生产治疗阿尔茨，其中使用式I化合物及其可药NHCH^N(CH3)2;海默病、血管性痴呆、阿尔茨海默病与脑血管障碍的组合、Tau突变、朊病毒病、聚谷氨酰胺扩展性障碍和帕金森综合征的药物。8.如权利要求1-4中一项或多项所要求的用途，用于生产治疗阿尔茨海默病、多发性脑梗塞痴呆、阿尔茨海默病与脑血管障碍的组合、Tau突变、朊病毒病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调和帕金森综合征的药物。9.如权利要求l-4中一项或多项所要求的用途，用于生产治疗在感染、脑外伤、脑胂瘤或中毒后和/或与之相关的继发性痴呆的药物。10.如权利要求1-4中一项或多项所要求的用途，用于生产改善记忆的药物。全文摘要本发明涉及5亚型Na⁺/H⁺交换泵(NHE5)抑制剂在生产用于治疗神经变性疾病、记忆障碍和痴呆疾病以及用于改善记忆保持的药物中的用途。文档编号A61K31/47GK101267822SQ200680034640公开日2008年9月17日申请日期2006年9月8日优先权日2005年9月20日发明者A·霍夫迈斯特,H·高尔,H-J·朗,H-W·克勒曼,K·雷曼,U·H·施罗德,U·海内尔特申请人:塞诺菲-安万特股份有限公司