的PH响应性 的"聚合物刷"表明，其由于聚合物上的磷酸根基团的质子化而改变薄膜纳米孔的整流行为 (Yameen，等人· Chem. Commun. 46,1908-1910(2010)。然而，这样的体系依赖于带电荷的分析 物（水合氢离子）以引出响应。在之前没有已知的在其中中性的分析物的结合导致纳米孔 环境的电荷状态的改变并且影响整流的纳米孔传感器。
[0227] 方法
[0228] 试剂和溶液：所有的储备溶液在Milli-Q超纯水中制备。缓冲溶液由氯化钾 (Baker)、磷酸钠（二氢）、碳酸钠和碳酸氢钠（Sigma)制备，并且使用HCl (IM)或Κ0Η(0. 1M) 调整。磺酸茜红（ARS)、8_羟基芘-1，3, 6-三磺酸、三钠盐（HPTS)、七叶亭、L-葡萄糖、和 L-果糖从Sigma购买。用于分析的所有缓冲溶液含有IOmM缓冲液和IOOmM氯化钾，除非另 有指示。
[0229] 聚合物PVP-BA的合成：聚（4-乙烯基吡啶）（Mff 60, 000)从Sigma购买并且不 加处理地使用。邻溴甲基苯基硼酸的合成使用现有的工艺进行。把聚（4-乙烯基吡啶） (0. 100g，.00167mmol)和间溴甲基苯基硼酸（0. 206g，0. 954mmol)加入包括磁力搅拌棒的 IOmL圆底烧瓶中。然后加入N，N-二甲基甲酰胺（2mL)和甲醇（2mL)以溶解试剂。把混合 物搅拌23小时，然后逐滴地加入容纳二氯甲烷（IOmL)的50mL烧杯中以沉淀产物。把烧杯 放置在冰浴中以允许产物完全沉淀。然后把溶液倾倒入具有可移除的顶部的二部分烧结过 滤器中并且在使用氩气的惰性条件下真空过滤。把产物使用3X15mL部分的二氯甲烷洗 涤，然后留在真空干燥器中以干燥过夜。所分离的产物是〇.257g (90 %产率）。IH-NMR示出 了聚合物的82%烷基化（数据未示出）。
[0230] 使用荧光测定法测量碳水化合物响应：制备由在甲醇/水（I: 1)中的 PVP-BA(0. 006% w/v)和HPTS(1. 5X 10 6M)组成的探针溶液。把一个等份的ImL的探针溶 液加入比色皿中，随后是ImL的碳酸盐缓冲液（20mM碳酸盐，IOOmM氯化钾，pH 9. 5)。使 用460nm(激发）和515-570nm(发射）的滤波器对读取荧光。加入等份的糖溶液（在水中 500mM)，通过缓慢地移液把溶液混合lmin，并且在每次加入之后测量荧光。加入的总体积不 超出20微升（总的体积的1% )。荧光信号被转换为荧光增量（F/F。）。来自多个空白值的 平均信号被用作基线荧光F。把每个信号除以该空白值得到荧光增量。
[0231] 使用石英纳米吸量管电极的电流测量：纳米吸量管从使用细丝的石英毛细管使用 P-2000激光拉制仪（Sutter Instrument Co.)制造，具有1.0 mm的外径和0· 70mm的内径 (QF100-70-5 ;Sutter Instrument Co.)。所使用的参数是：热 625、细丝 4、速度 60、延迟 170并且拉动180。为了测量离子电流，使用二电极设置。把纳米吸量管使用缓冲溶液（磷 酸盐/KC1，pH7)回填并且插入一个Ag/AgCl电极。把另一个Ag/AgCl电极放置在0. 3mL 本体溶液中，作为辅助/参比电极起作用。把两个电极二者都连接于具有DigiData 1322A 数字化器的Axopatch 700B放大器（Molecular Devices)以及配备有pClamp 10软件的 PC(M〇lecular Devices)。为了确保纳米吸量管电极的完全的润湿，在被缓冲液回填之后把 纳米吸量管末端浸没在N，N-二甲基甲酰胺中5-10秒。正电势是指被施加于纳米吸量管的 圆筒中的相对于反电极的电极的阳极电势。实验在24°C进行。
[0232] 把PVPBA内嵌在纳米吸量管中：把纳米吸量管圆筒使用磷酸盐缓冲液（pH 7)填充 并且浸没在容纳反电极的碳酸盐缓冲液（pH 9.5)中。在验证纳米吸量管显示负的电流整 流之后，把它们短暂地浸没在含有0.03% (w/v)聚合物的甲醇溶液中，然后返回至碳酸盐 溶液。聚合物的成功的固定化导致整流完全的逆转。
[0233] 测量与被聚合物改性的纳米吸量管的碳水化合物响应：把改性的纳米吸量管在 0.30mL的容纳反电极的碳酸盐缓冲溶液（pH 9. 5)中分析。把等份的在纯水中的浓缩的分 析物溶液加入溶液中。加入的总体积不超出15 yL，以把体积的改变限制于5%。为了实时 地测量响应，使用以0. 5Hz的频率的-500至+500mV的正弦电势分析电流。在加入等份之 后，信号已经稳定化之后，通过以0. 5mV/ms的速率从-500至+500mV扫过电压分析电流。每 次测量由5次扫过组成。
[0234] 电化学数据分析：把被pClamp软件记录（取样频率对于电压扫过1000 Hz，对于正 弦函数200Hz)的离子电流测量值输入至OriginPro 8. 5(0rigin Labs)以进行分析和绘 图。为了生成对于每个数据点的I-V曲线，把以500mV s 1的扫描速率从-800至+800mV的 5个电压扫过取平均值并且对于每个点计算标准偏差。为了生成结合等温线，对固定电势的 电流随分析物浓度的变化作图。
[0235] 官能化聚合电解质的化学件质
[0236] 为了制造阳离子型的对碳水化合物响应性的聚合物，使用间溴甲基苯基硼酸烷基 化可商购获得的具有分子量60, 000的聚（4-乙烯基吡啶）（PVP)。产物PVP-BA从N，N-二 甲基甲酰胺和甲醇中的反应混合物沉淀。其是在甲醇中弱地可溶解的（高至l%w/v)，在 酸性的甲醇/水溶液中几乎不可溶解的，并且在其他的水性的和有机的溶剂中实际上不可 溶解的。聚合物的被苄基化的形式（PVP-Bn)(被溴化苄烷基化）显示出更高的溶解度。聚 合物的烷基化效率通过对IH-NMR谱积分来确定。聚合物PVP-BA显示出约85 %烷基化，而 对于PVP-Bn烷基化效率是90%。这些值被用于把聚合物的摩尔质量估计为对于PVP-BA 170, 000并且对于PVP-Bn 150,000。聚合电解质例如聚乙烯基吡啶可以通过滴定被分析以 表征蛋白质摄入和表观pKa。
[0237] 为了评价聚合物PVP-BA的pH依赖性，在甲醇/水中的1% w/v的溶液被酸化至pH 2。当被使用氢氧化物滴定时，聚合物在约pH 8迅速地沉淀。该沉淀点是高度可再现的，并 且是与苯基硼酸的在溶液中的PKa -致的。在该点，硼酸的向硼酸盐的转化将有效地中和 来自吡啶鑰基团的电荷，形成具有少得多的极性的两性离子型聚合物。该沉淀点在20mM单 糖的存在下被调制（见沉淀时的PH数据，图20)，其已知把硼酸的pKa降低差不多2pH单 位。与PVP-BA的在pH 7. 8±0. 2的沉淀比较，葡萄糖使沉淀在pH 6. 5±0. 1发生，并且果 糖导致在pH 5. 58±0. 08的沉淀。果糖已知具有与大多数硼酸受体的高的亲合力。本工作 显示出葡萄糖和果糖二者都结合于所使用的PVP-BA。本方法可以被用于确定各种聚合电解 质是否可以被用作在纳米吸量管上的涂层，以及用于调整聚合物的PH响应性，例如通过加 入带负电荷的基团或改变带负电荷的基团的位置。
[0238] 为了更好地表征阳离子型聚合物与碳水化合物的相互作用，三个比色的染料被选 择，其可以每个与聚合物PVP-BA和PVP-Bn互相作用。这些染料作为用于葡萄糖感测的代 用品起作用，是可商购获得的，并且具有已公开的结构。磺酸茜红（ARS)含有儿茶酚和负电 荷二者，七叶亭仅含有儿茶酚，并且8-羟基芘-1，3, 6-三磺酸是三钠盐（HPTS)和具有三个 负电荷的染料。每个染料的溶液被聚合物滴定，并且吸光度谱被记录。用于ARS染料的一 个代表性的吸光度谱在图21中示出，与PVP-BA或PVP-Bn共同地。在不含有硼酸的PVP-Bn 的存在下，在420nm的吸光度最大值减小并且被略微地红移至432nm。当PVP-BA被加入染 料中时，最大吸光度增加并且被迀移至467nm。这两个不同的现象显示出由硼酸结合和静电 相互作用二者导致的相互作用。此外，ARS结合于BA聚合物，但是不结合于Bn聚合物。
[0239] 通过测量在λ_的吸光度的差异，获得示出了随聚合物浓度变化的Λ A曲线。使 用曲线的线性部分的斜率测量每种染料对聚合物的灵敏性，在表格1中汇总。对于PVP-BA 被附加于硼酸的聚阳离子来说，对ARS的亲合力是HPTS的亲合力的二倍，显示出静电吸引 和键形成二者的协同效应。相反地，PVP-Bn显示出与ARS相比的对HPTS的更强的亲合力， 与所有的静电机理一致。显著地，对七叶亭的亲合力对于PVP-Bn比PVP-BA低一个数量级。 这显示出如果没有硼酸的存在，在聚阳离子和没有电荷的儿茶酚之间几乎没有相互作用。 虽然把Λ A相对于聚合物浓度作图产生对于所有的被测试的染料的平滑的曲线，但是没有 一个显示出与标准的结合等温线的良好的拟合。这可能是由于聚合物的复杂性质，其具有 多个结合位点（每个聚合物链约500个）并且可以在染料的存在下经受团聚。
[0240] TABLE 1 :聚合物的对比色的染料的相对亲合力。
[0241]
[0242] 注意：染料使用聚合物的溶液被滴定，并且斜率被计算作为λ _的改变随聚合物 浓度的变化。
[0243] 被官能化聚合物内嵌的纳米吸量管
[0244] 为了形成被含有硼酸的聚阳离子PVP-BA官能化的纳米通道，被磷酸盐缓冲液填 充的石英纳米吸量管（孔径20-40nm)被使用。在该介质中，聚合物是不可溶解的。在聚合 物的加入之前，这些显示出在pH 7的被负整流的离子电流。即，IV曲线示出了在负电压更 高的电流。为了使用聚合物官能化纳米通道，纳米吸量管被短暂地浸没在含有以〇. 3%浓 度（w/v)的聚合物的甲醇溶液中。在把纳米吸量管末端返回至中性的缓冲溶液时，整流被 逆转，显示出在正电势更高的非线性的电导。PVP-BA吸量管显示出在+电压的更大的离子 电流以及在负电势几乎没有电流。
[0245] 被反转的整流是聚合物渗透纳米吸量管的孔的证据，其中系统的阻抗是最高的。 几个这样的被聚合物改性的纳米通道被产生，在其中正的整流是在几小时内稳定的。在纳 米吸量管的外侧没有聚合物是可见的。假定地，被改性的离子电流来源于被内嵌在纳米通 道中并且被向带负电荷的石英的静电吸引和在缓冲液中的有限的溶解度二者保持就位的 聚合物。纳米通道内的聚合物的成像是不切实际的，但是为了近似于体系，微吸量管经受相 似的处理。具有20微米孔径的微吸量管被含有ImM ARS的磷酸盐缓冲液填充以用于聚合 物的可视化。在聚合物的甲醇溶液中的浸没产生在微吸量管的末端处的紫颜色。甚至在20 分钟之后，非常少的聚合物向上扩散入吸量管末端的更宽的开口中。
[0246] 被改性的纳米吸量管电极的pH灵敏性很大地大于石英纳米吸量管。未修饰的石 英纳米吸量管的负的整流显示出在pH 3的仅略微的减小，相应于硅烷氧基团的质子化。相 反地，具有内嵌的PVP-BA的纳米吸量管显示出在pH 8至pH 3的负电势实际上没有电导 (数据未示出）。在正电势的电导随着减小的pH增加，显示出在pH 5和pH 3之间的最多 的改变。纳米通道/聚合物材料的电化学行为不从溶液中的聚合物的性质被预测，其经受 质子化状态的在pH 7和8之间的最大的改变。
[0247] 阴离子型儿茶酚ARS显示出在被测试的染料中最高的在溶液中对聚合物PVP-BA 的亲合力。为了测试离子选择通透性的使用该染料的调制，被聚合物改性的纳米吸量管被 浸没在PH 9. 5的碳酸盐缓冲液中。在这些碱性条件下，阴离子型硼酸酯的形成被确保。如 图22中所示的，少至60μΜ ARS足以负化被改性的纳米通道中的所有的正的整流。使用 360 μΜ ARS，电流被负地整流。参照图22,在360处的箭头显示出在负电压的增加的负电 流。在本实施例中，约-InA的负电流在-500mV被观察到，并且+500mV导致约+0. 6ηΑ。本 实施例还示出了 ARS的空白的、60 μΜ和360 μΜ浓度可以如何被区分。因为离子电流整流 成为被逆转的，所以染料的加入不表现为导致纳米孔或纳米通道堵塞。而是，通道的离子渗 透性基于静电荷的在基质内的逆转被逆转。
[0248] 在ARS的低浓度（〈0.1 mM)，离子电流整流的调制是完全地可逆的，不需要洗涤介 质。更高的浓度使体系成为永久地被负地整流的。这可以是由于聚合物和染料之间强的相 互作用，特别是如果染料深地渗透入聚合物基质中，其被防止扩散入本体溶液中。
[0249] 所示出的被改性的纳米通道中的离子电流整流的使用ARS的逆转可以是由于染 料的电荷以及含有硼酸的基质中的PKa迀移二者。对于中性的碳水化合物，整流的改变必 须被归因于纳米通道中的硼酸/硼酸盐平衡。果糖（IOmM)的向被聚合物内嵌的纳米通道中 的加入导致整流从正至负的快速倒转（图23-24)。图23中的曲线示出了在空白的纳米吸 量管中几乎不具有整流，而在IOmM的果糖的存在导致展示负的整流（即在负电压的更高的 电流）的IV曲线。图24示出了结合的可逆转性，在其中用于电流整流的完全的逆转的响 应时间是3至5分钟，在暴露于果糖时以及在把纳米吸量管末端返回至纯的缓冲液时。引 人注意地，初始的被正向地整流的I-V曲线的仅一个部分在向果糖的暴露之后被恢复。如 图23中所示的，在负电势的电导经受在果糖暴露的重复的循环中的完全的并且可再现的 切换。对于正电势不一定是这样。如图23中所示的，用于被PVP-BA改性的纳米吸量管的初 始的信号是在高至600mV的正电势高度地打开的。这种打开的状态在向果糖的暴露之后不 成为被完全地恢复的。这指示纳米通道中的基质的某些调节，作为碳水化合物结合的结果。 虽然电流整流的量级是在不同的被聚合物内嵌的纳米通道之间不同的，但是整流的在果糖 的存在下的倒转是对于几个被测试的体系完全的并且可逆的（图25)。示例性的点254和 255分别地示出了在不同的实验中的正的和负的整流。
[0250] 因为在负电势的电流响应的完全的逆转，在固定的负电势的电流可以被用于示出 在打开状态和关闭状态之间的被果糖改性的门控制。如图24中所示的，在-500mV的电流 是使用果糖暴露的几个循环完全地可逆的。重要地，不具有为了恢复信号所需要的洗涤条 件。从I-V曲线的平滑性还应当注意，聚合物基质不表现为被电场影响。而是，仅中性的碳 水化合物的存在调制纳米通道中的离子渗透性。
[0251] 被改性的纳米通道的对果糖的响应，如使用ARS的，是依赖于浓度的（图26-27)。 通过把在_500mV的电势的电流随果糖浓度的变化作图，结合亲合力可以被对于给定的纳 米通道确定，由以下的等式给出：
[0252] S = (l+SnaxKb[A])/(l+Kb[A])
[0253] 该模型使用S作为信号，在这种情况下离子电流，S_作为在使用分析物饱和时的 计算出的信号，[A]作为分析物浓度，并且K b作为以M 1的单位计的结合常数。从曲线的拟 合确定的结合常数是对于所示出的纳米通道360 ± IIOM 1，这是与使用在溶液中的单苯基硼 酸测量的结合常数一致的。这些亲合力可以宽范围地变化，但是通常在100至5000M 1的范 围内。为了比较被纳米通道约束的聚合物的对溶液相聚合物的响应，进行基于荧光的鉴定， 其相似于纳米通道电极地被静电荷调制。使用染料HPTS，别构指示器位移鉴定（AIDA)被用 于测量果糖响应。在溶液中，HPTS与PVP-BA聚合物形成基态络合物，猝灭荧光。两个组分 被静电地吸引；阳离子型聚合电解质向阴离子型染料。在PH 9.5,果糖的加入使聚合物上 的硼酸基团成为阴离子型硼酸盐，中和聚合物上的总体的正电荷并且代替荧光性染料。使 用该体系，表观结合常数被确定为对于果糖3200±400M 1 (图26)。该亲合力比使用在圆锥 形的纳米通道中的聚合物测量的亲合力大一个数量级，但是仍然良好地在对于硼酸-果糖 结合报道的值内。虽然用于聚合物的环境是对于两个体系非常不同的，但是在两种情况下 是在聚合物电荷中的调制给出信号。使用被良好地特征化的受体基质迅速地建造对刺激响 应性的纳米流体二极管的能力提供了用于控制纳米孔中的离子渗透性的新的策略。
[0254] 因此，图25和26中的数据显示出在被接受的鉴定中获得的荧光值是与在所设置 的负电压的在果糖的变化的浓度获得的离子电流值可比较的，并且本发明的电化学方法具 有比荧光方法高的动态范围。
[0255] 包括被PVP-BA聚合物内嵌的纳米吸量管的传感器还被显示出在pH9. 5以负的整 流的增加响应于葡萄糖。显示出在缓冲液中的1. 42的负的整流比的传感器被暴露于20mM 葡萄糖，此时增加的负电流导致1. 99的负的整流比。负电流比被定义为在电势-500mV的 电流与在电势+500mV的电流的比。
[0256] 结论
[0257] 上文的专门的描述意图示例并且例证本发明并且不应当被视为限制本发明的范 围，本发明的范围被所附的权利要求的字面的和等效的范围限定。在本说明书中提到的任 何专利或公布意图传递在实施本发明的某些方面中有用的方法和材料的可能未被明确地 提出但是将被本领域的技术人员理解的细节。这样的专利或公布在此通过引用并入，至如 同每个被特别地并且分别地通过引用并入并且在本文中容纳的相同的程度，如为了描述和 体现所指代的方法或材料的目的所需要的。
【主权项】
1. 一种用于从溶液中的两种不同的离子产生离子化合物的方法，包括： (a) 提供在纳米吸量管的内侧的溶液中具有电荷的至少一种第一离子，所述纳米吸量 管在所述纳米吸量管的内部和外部溶液之间具有纳米孔； (b) 提供在所述外部溶液中的第二离子；以及 (c) 把横跨具有相反电荷的所述纳米孔的电压施加于在纳米吸量管的内侧的溶液中具 有电荷的所述第一离子，所述电压足以导致所述第二离子向所述纳米孔迀移以与所述第一 离子反应以形成离子化合物。2. 根据权利要求1所述的方法，还包括测量经过所述纳米孔的离子电流并且检测指示 所述离子化合物的形成的电流的改变的步骤。3. 根据权利要求1所述的方法，其中指示所述离子化合物的形成的所述电流的改变是 振荡。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述离子化合物是不可溶解的。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一离子或所述第二离子是与阴离子反应形 成所述离子化合物的金属阳离子。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述金属阳离子是过渡金属。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述金属阳离子选自由以下组成的组：Mg 2+、Ca' Mn' Zn' Cu' Fe' Fe3+、Cr3+、Cr6+、Cd2+、Mo 2+、Co3+、Co' Hg' Ni' Al' Al' Ar3+、Ar3 以及 Pb2+〇8. 根据权利要求5所述的方法，其中所述阴离子选自由以下组成的组：磷酸根、氯离 子、硫酸根、单磷酸根、焦磷酸根、偏磷酸根、三聚磷酸根、四偏磷酸根以及正磷酸根。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述阴离子选自由有机羧酸阴离子组成的组，所 述有机羧酸阴离子选自由以下组成的组：葡糖酸根、酒石酸根、富马酸根、马来酸根、丙二酸 根、苹果酸根、乳酸根、柠檬酸根、H)TA、柠康酸根、柠苹酸根、硬脂酸根、油酸根、月桂酸根、 辛酸根、抗坏血酸根、吡啶甲酸根和乳清酸根。10. 根据权利要求5所述的方法，其中所述阴离子是蛋白质。11. 根据权利要求1所述的方法，还包括在沉淀物形成之后逆转所述电压的步骤。12. 根据权利要求1所述的方法，还包括检测所产生的离子化合物的形成的步骤。
【专利摘要】公开了用于检测离子迁移和结合的方法和装置，其利用适用于在电化学感测电路中使用的纳米吸量管。纳米吸量管可以借助用于结合和感测金属离子的金属螯合剂或其他的特异性结合分子例如用于结合和感测葡萄糖的硼酸在其内部孔隙上被官能化。这样的官能化的纳米吸量管被包括在检测纳米吸量管何时选择性地并且可逆地结合离子或小分子的电传感器中。还公开了用于通过电压导向的离子迁移控制水溶液中的沉淀的包括纳米吸量管的纳米反应器，其中离子可以通过孔隙中的排斥电荷被引导离开内部孔隙。
【IPC分类】G01N27/26, G01N33/487
【公开号】CN105044170
【申请号】CN201510382728
【发明人】纳德·普曼德, 波阿斯·维洛兹尼, 保罗·阿克蒂斯, R·亚当·赛格, 巴克森·辛加拉姆
【申请人】加利福尼亚大学董事会
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2012年3月2日
【公告号】CN103502804A, CN103502804B, EP2681542A2, EP2681542A4, US8980073, US20120222958, US20150177189, WO2012122029A2, WO2012122029A3