塞杆施压使液体通过净化柱和微孔滤膜流出，控 制流速1~I. 2mL/min，使用进样瓶盛接过滤液，供高效液相色谱串联质谱仪测定。
[0052] 3、仪器方法
[0053] Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（1.7 μ m、2. IXlOOmm);柱温：40°C ;样品 室温度4°C;进样体积5. 0 μ L ;流动相A为0. 1 % (V/V)甲酸水溶液，流动相B为0. 1 % (V/ V)甲酸甲醇，梯度洗脱条件见表1，流速为0. 35mL/min。
[0054] 表1流动相梯度条件 CN 105181858 A 机切 4/6 页
[0057] 质谱采用电子喷雾离子源（ESI)，正离子扫描方式，多反应监测（MRM)模式；毛细 管电压为2. 83kV ;毛细管温度为450°C;实验所用脱溶剂气为高纯氮气，流速为900L/Hr，碰 撞气为高纯氩气，流速为〇. 13mL/min。使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要 求。三种待测目标物的保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等信息见表2,三种化 合物定量定性离子色谱图见图2。
[0058] 表2化合物名称、保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量
[0060] * 定量离子（Quantification ion) 〇
[0061] 4、方法线性范围和检出限
[0062] 适量移取混合标准工作液，用空白玉米样品提取液配制成浓度分别为5. 0、10、50、 200、500、1000ng/mL的基质匹配标准溶液，按照上述样品前处理方法进行净化处理，液相色 谱串联质谱仪测定，以定量离子3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限。结果表明，3 种化合物在I. 〇~l〇〇〇ng/mL浓度范围内的线性方程，线性系数R2均大于0. 990,结果见表 3〇
[0063] 表3线性方程、相关系数R2、检出限、定量限
[0064] CN 105181858 A 兄明干ι 5/6 页
[0065] 5、方法的精密度和加标回收试验
[0066] 采用猪尿液基质加标回收实验，加标浓度分别为20、100、500 μ g/kg，平行6次，基 质匹配标准溶液进行定量。不同浓度水平下，各待测物回收率均在80%~110%之间，相对 标准偏差（RSD)均小于20%。结果见表4。
[0067] 表4不同添加浓度下回收率和相对标准偏差（η = 6)
[0069] 二、参比样品检测结果比对
[0070] 应用本方法对参比样品（美国TRILOGY公司，天然污染玉米基质，批号： MTC-9999E)进行检测，DON检测值为2635 yg/kg，与参比值2600 yg/kg，l倍标准偏差 (Isd)范围：2400~2800 μ g/kg相比，检测值位于其Isd范围内，表明该方法准确性满足检 测要求。
[0071] 注：15-ACD0N和3-ACD0N属于非常规检测的霉菌毒素，目前的相关研究较少，没有 关于此两种物质的参比样品，其检测准确度的判定可以根据上述"方法的精密度和加标回 收试验"结果。
[0072] 实施例3、净化材料选择与组合比例筛选试验
[0073] 采用纯水作为提取溶液对谷物样品中DON及其2种乙酰化衍生物进行提取的同 时，也会引入大量的水溶性杂质，主要包括糖类、金属离子、色素、脂肪酸、小肽和氨基酸等 物质。通常情况下，由于样品提取液中含有大量杂质，未经净化处理则不能直接用于LC-MS/ MS检测。否则，一方面会对检测设备和色谱柱造成损害，另一方面由于杂质（主要是糖、金 属离子、色素、脂肪酸等）干扰带来的强烈基质效应会严重降低待测目标物的检测灵敏度。 杂质吸附原理就是在样品提取液流经净化柱的过程中，净化柱的吸附材料非特异性吸附杂 质，而待测目标物则通过净化柱存在于过滤液中。C18、酸性氧化铝（A-Al2O3)、N-丙基乙二 胺（PSA)和氨基（-NH2)都是常用的吸附材料，首先选择了一种色素含量较高的玉米DDGS样 品对上述材料的净化效果以及对目标物吸附性进行了考察，发现PSA和A-Al2O3在感官净化 效果和提高检测灵敏度方面均有明显效果，见表5。
[0074] 表5不同吸附材料净化效果考察（玉米DDGS基质）
[0077] 由于PSA和A-Al2O3属于不同类型的吸附剂，因此，进一步对PSA和A-Al 203组合 比例进行了试验筛选。具体方法如下：设定净化材料总量为400mg时5种不同的组合比例 (PSA = A-Al2O3分别为4:0, 3:1，2:2, 1:3, 0:4)，按照上述方法制备成相应的净化柱，按照实 施例2描述的方法，分别对5种净化柱净化的感官和仪器检测效果进行考察。试验结果见 表6，从中可以看出，PSA和A-Al2O3在总量400mg净化Iml玉米DDGS样品提取液时，PSA和 A-Al2O3比例在3~1:1时对于去除提取液中的色素和提高检测灵敏度方面效果最佳。因 此，综合考虑实际样品检测的效果和可操作性，选取A-Al2O3和PSA为1:1~3的比例组合。
[0078] 表6两种净化材料（PSA和）组合比例筛选试验结果
【主权项】
1. 一种杂质吸附型净化柱，其特征在于：该净化柱的填料是由酸性氧化铝填料与N-丙 基乙二胺组成的混合型填料。2. 根据权利要求1所述的净化柱，其特征在于：该净化柱由柱管和从所述柱管的进液 口至所述柱管的出液口依次设于所述柱管内的上筛板、所述填料和下筛板组成。3. 根据权利要求1或2所述的净化柱，其特征在于：所述上筛板和所述下筛板的材质 均为聚乙烯； 所述上筛板和所述下筛板的孔径均为5~10ym; 所述柱管的内径为5~12_，长度为50~60mm; 所述酸性氧化铝填料与所述N-丙基乙二胺的质量比为1:1~3 ; 所述酸性氧化铝的粒径为100~200目； 所述N-丙基乙二胺的粒径为40~60ym; 所述混合型填料的填充量为400~500mg。4. 权利要求1-3中任一项所述的净化柱的制备方法，包括如下步骤：1)将N-丙基乙二 胺和酸性氧化铝混合，得到混合型填料； 2)在所述管柱的出液口端，安装所述下筛板，然后向所述管柱内加入所述混合型填料， 再于所述管柱的进液端的所述混合型填料上安装上筛板，即得到所述杂质吸附型净化柱。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述上筛板和所述下筛板的安装方式均 为过盈配合。6. 权利要求1-3中任一项所述的净化柱在纯水提取用于高效液相色谱串联质谱法测 定的谷物和/或谷物加工副产品中霉菌毒素的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述谷物为玉米、小麦、大麦或稻米； 所述谷物加工副产品为玉米胚芽柏、玉米酒精糟、小麦麸或米糠； 所述霉菌毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰化脱 氧雪腐镰刀菌烯醇中至少一种。8. 权利要求1-3中任一项所述的净化柱提取用于高效液相色谱串联质谱法测定的谷 物和/或谷物加工副产品中霉菌毒素的方法，包括如下步骤：将待测谷物和/或谷物加工副 产品中加入蒸馏水，震荡超声，然后离心处理取上清液；将所述上清液通过所述净化柱的进 液口依次通过所述上筛板、所述混合型填料和所述下筛板，然后从所述净化柱的出液口流 出，经与净化柱的出液口连接的微孔滤膜过滤，得到用于高效液相色谱串联质谱法谷物中 霉菌毒素。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述谷物和/或谷物加工副产品的粒径 为20~40目； 所述谷物和/或谷物加工副产品与所述蒸馏水的质量体积比为Ig:4~5mL; 所述上清液的体积为1~I. 5mL; 所述上清液在所述净化柱内的流速为1~I. 2mL/min。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述微孔滤膜的直径为13~17mm， 孔径为〇. 22ym。
【专利摘要】本发明公开了一种杂质吸附型净化柱及其制备方法与应用。本发明净化由柱管和从所述管柱的进液口至所述管柱的出液口依次设于所述管柱内的上筛板、混合型填料和下筛板组成；所述混合型填料由酸性氧化铝填料与N-丙基乙二胺组成。本发明净化柱应用在纯水提取用于高效液相色谱串联质谱法测定的谷物和/或谷物加工副产品中霉菌毒素。本发明对流过净化柱的液体待测样品中霉菌毒素进行选择性吸附，提取的洗脱液为纯水，不添加有机溶剂，从而使干扰质谱检测的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物杂质被吸附在净化柱上，经净化的流出液再经微孔滤膜过滤后，可直接用于液相色谱串联质谱仪进行上机测定。
【IPC分类】G01N30/14
【公开号】CN105181858
【申请号】CN201510594900
【发明人】王瑞国, 苏晓鸥, 王培龙, 张维, 李阳, 索德成
【申请人】中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月17日