于所述肽获得同时质谱数据，并将该同时质谱数据与对于转基因表达的所 述预期产物提供的质谱数据相比较，由此确定转基因表达的所述预期产物在所述转基因植 物品种的第一世代中存在与否；
[0049] (vii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基因植物品种的第二 世代的蛋白质；
[0050] (viii)用包含来自所述转基因植物品种的第二世代的蛋白质的复杂样品重复步 骤（iii)-(vi);和
[0051] (ix)若在对于来自所述转基因植物品种的第二世代的复杂蛋白质样品所得的肽 的质谱数据中无法确证转基因表达的预期产物的存在，则无法繁殖所述转基因植物品种的 第二世代，由此维持所述转基因植物品种的基因型。
[0052] 18.项17的方法，其中步骤（iii)中消化的蛋白质是在单一步骤中消化的。
[0053] 19.项17的方法，其中步骤（iv)中分离的肽是在单一步骤中分离的。
[0054] 20.项17的方法，其中步骤（v)中电离的肽是在单一步骤中电离的。
【附图说明】
[0055] 图1显示AAD-1的LC\MS\MS多重检测。具体显示了AAD-1蛋白的多重肽/碎片 离子的检测。
[0056] 图2显示AAD-12的LC\MS\MS多重检测。具体显示了AAD-12蛋白的多重肽/碎 片离子的检测。
[0057] 图3显示CrylF的LC\MS\MS多重检测。具体显示了CrylF蛋白的多重肽/碎片 离子的检测。
[0058] 图4显示Cry34的LC\MS\MS多重检测。具体显示了Cry34蛋白的多重肽/碎片 离子的检测。
[0059] 图5显示Cry35的LC\MS\MS多重检测。具体显示了Cry35蛋白的多重肽/碎片 离子的检测。
[0060] 图6显示PAT的LC\MS\MS多重检测。具体显示了PAT蛋白的多重肽/碎片离子 的检测。
[0061] 图7显示在近交玉米组织中表达的CrylF的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在 近交5XH751XT中CrylF的检测。
[0062] 图8显示在近交玉米组织中表达的Cry34的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在 近交5XH751XT中Cry34的检测。
[0063] 图9显示在近交玉米组织中表达的Cry35的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在 近交5XH751XT中Cry35的检测。
[0064] 图10显示在近交玉米组织中表达的PAT的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在近 交5XH751XT中PAT的检测。
【具体实施方式】
[0065] 在质谱方法中对于从复杂样品鉴定单个蛋白质所允许的特异性的独特之处在于 仅需要目标蛋白的序列以鉴定目标蛋白。与其他形式的多重方法（multiplexing)相比，质 谱法的独特之处在于能够利用蛋白质初级氨基酸序列的全长以靶向蛋白质初级氨基酸序 列独特的标识类型部分以实际上消除非特异性检测。在本发明的一些实施方案中，使用独 特地鉴定目标蛋白的蛋白水解片段或蛋白水解片段组以在复杂蛋白质样品中检测目标蛋 白。
[0066] 泛言之，本发明的具体方法允许直接监视并从目标组织量化任何蛋白质，仅需要 事先知晓所述蛋白质氨基酸序列。该方法可以以高通量方式实施而无需开发/测试方法特 异性检测试剂。拥有纯化的蛋白质作为供方法开发的试剂总是有益的，但对于该分析仅能 纯化至例如60%的蛋白质对于方法开发仍为充分的。本公开的方法可使本领域技术人员 消除开发用来制备高度纯化的蛋白样品以用于抗体产生的常常具挑战性的方法的需要。因 此，本公开的方法可节约时间和资源。而且，该方法提供了更多种类的适用于多重分析的蛋 白质试剂，因为可能无需移除例如最后30-40%污染物的努力。公开的方法亦代表了相对于 基于DNA扩增的多重方法的亟需改善，所述方法需要经验性测试基因特异性引物和热循环 仪条件，并且由于DNA检测所需的指数扩增而导致了其中欠缺任何靶特异性可显著地降低 方法的准确性的情况。
[0067] 在具体实施方案中，本发明的方法使得蛋白质反向工程能够确定为何具体蛋白质 具有其独特性质而无需实际蛋白质以起始研究。举例而言，可从来自表达需要或不需要的 性状的植物的复杂蛋白质样品所得的质谱数据鉴定与需要或不需要的植物性状相关的靶 蛋白序列修饰和/或翻译后修饰。
[0068] 在一些实施方案中，公开的方法使得能够通过单次质谱分析在复杂蛋白质样品中 量化或确定多种蛋白质的比例，而非多次单独测量每种目标蛋白，并将单独的结果汇编至 一个样品结果。
[0069] 还在其他实施方案中，本公开亦提供了可用于转基因植物技术的开发和使用的方 法。具体而言，公开的方法可用于在后续世代中维持转基因植物的基因型。同样，本文中公 开的方法的一些实施方案可用于提供有从邻近植物例如通过交叉授粉而受转基因污染风 险的非转基因植物的高通量分析。通过这些实施方案，可促进和/或实现转基因的生物限 制。在其他实施方案中，本文中公开的方法可用于以高通量方式筛选植物转化方法的结果 以鉴定显示所需表达特征的转化体。
[0070] I.缩写
[0071] 对本发明参照下述缩写加以描述：
[0072] AAD-1 (R) _2, 4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶（dichlorophenoxypropionate dioxygenase)
[0073] AAD-12(S)_2,4-二氯苯氧基丙酸/α-酮戊二酸双加氧酶 (dichlorophenoxypropionate/alpha-ketoglutaratedioxygenase)
[0074] CID碰撞诱导的解离（Collision-induceddissociation)
[0075] CrylF杀虫晶体蛋白（Pesticidalcrystalprotein)crylFa(杀昆虫的delta-内 毒素（Insecticidaldelta-endotoxin)CrylF(a))
[0076] Cry34 晶体蛋白（crystalprotein)ET79 (苏云金芽抱杆菌（Bacillus thuringiensis))
[0077] Cry35Cry35Ab类似物（Cry35Ab_like)(苏云金芽孢杆菌）
[0078] CE毛细管电泳
[0079] DNA脱氧核糖核酸
[0080] ELISA酶联免疫吸附分析
[0081] EPI增强的产物离子（enhancedproduction)
[0082] GM经遗传修饰的
[0083] IDA基于信息的米集（information-dependentacquisition)
[0084] LC\MS\MS液相层析-串联质谱法（liquidchromatography-tandemmass spectrometry)
[0085] MRM多反应监视（multiplereactionmonitoring)
[0086] MS质谱法
[0087] MSMS串联质谱法
[0088] PAT草胺勝N-乙酰转移酶（PhosphinothricinN-acetyltransferase)(PPTN-乙 酰转移酶）
[0089] PCR聚合酶链式反应
[0090] RT-PCR逆转录聚合酶链式反应
[0091] II.术语
[0092] 为了便于审视本公开的多种实施方案，下述给出了具体术语的解释：
[0093] 生物限制（Bioconfinement):如用于本文，术语"生物限制"指将经遗传修饰的植 物或其遗传材料的移动限制于指定区域。该术语包括防止经遗传修饰的植物在自然环境或 人工生长条件中存活、散布或复制的物理、物理化学、生物学限制，以及任何其他形式的限 制。
[0094] 复杂蛋白质样品：如用于本文，术语"复杂蛋白质样品"是用于将样品区别于纯化 的蛋白质样品。复杂蛋白质样品包含多种蛋白质，且还可包含其他污染物。
[0095]质谱法：如用于本文，通用术语"质谱法"指任何合适的质谱方法、装置或结构 (configuration)，包括例如电喷射电离（ESI)、基质辅助激光解吸/电离（MALDI)MS， MALDI-飞行时间（TOF)MS，大气压（AP)MALDIMS，真空MALDIMS，串联MS，或其任意组合。 质谱装置通过测量分子通过一组磁场和电场的飞行路径来测量分子的分子量（作为该分 子的质荷比的函数）。质荷比是广泛用于带电粒子的电动力学的物理量。特定肽的质荷比 可由本领域技术人员先验地计算。当施以相同的电场和磁场时，具有不同质荷比的两个粒 子在真空中不会以相同路径移动。本发明包括使用高效液相层析（HPLC)继以对肽的串联 MS分析，但不限于此。
[0096] 质谱仪器由三个模块组成：离子源，其将样品分子裂解为离子；质量分析器，其通 过施加电磁场根据离子质量将它们归类；和检测器，其测量指示量（indicatorquantity) 的值，并从而对于计算每种存在的离子的丰度提供数据。该技术同时为定性和定量用法。这 包括鉴定未知化合物，确定分子中元素的同位素组成，通过观察其碎片来确定化合物结构， 和对样品中化合物的量定量。
[0097] 质谱方法学和装置的详细综述可见于下述文献：Carr和Annan(1997)0verview ofpeptideandproteinanalysisbymassspectrometry.In:CurrentProtocolsin MolecularBiology,Ausubel等编辑NewYork:Wiley,p. 10. 21. 1-10. 21. 27;Paterson 和Aebersold(1995)Electrophoresis16:1791-1814 ;Patterson(1998)Protein identificationandcharacterizationbymassspectrometry.In:CurrentProtocols inMolecularBiology，Ausubel等编辑NewYork:Wiley,p. 10. 22. 1-10. 22. 24 ;以及Domon 和Aebersold(2006)Science312 (5771) : 212-17,其通过提述并入本文。
[0098] 多重：如该术语用于本文，当两种或更多种目标蛋白质和/或肽存在于相同样品 中时，则所述蛋白质和/或肽是"多重的"。
[0099] 植物性状：如用于本文，"植物性状"可指植物的任何单个特征或可量化的量度。 [0100] 肽：肽为由α氨基酸以限定顺序连接而形成的短聚合物。肽亦可通过用蛋白酶消 化多肽例如蛋白质来生成。
[0101] 蛋白质：蛋白质为由氨基酸以直链排列并通过邻接氨基酸残基的羧基和氨基基团 之间的妝键结合在一起而构成的有机化合物。蛋白质中氣基酸序列是由基因序列定义的， 而基因是在遗传密码中编