法以满足如蛋白质稳定性、溶解性和疏水性等因素。
[0164] 简单的碳酸氢铵蛋白质提取的吸引力在于能够直接从提取步骤进行至蛋白酶消 化而无需在MS分析过程中考虑由于缓冲液组成所致的信号抑制。这可减少成本，但是更重 要的是减少准备时间和在缓冲液交换中可能招致的差异。测试了 8M尿素缓冲液以确定是 否需要严酷的增溶方法以供检测植物组织中所有四种蛋白质。使用PBS-T是因为其对于 ELISA检测方法是常规的。
[0165] 5XH751XT叶组织：从V6-V7温室植物收集叶组织，并在液氮下磨碎。每个叶样品 测试重量为1. 5g。每种提取缓冲液（图11)以2:1缓冲液/样品比例（3mL)测试。将样品 涡旋振荡2分钟，然后旋转2分钟，并收集上清。
[0166] 5XH751XT种子组织：获得成熟的种子组织，并将其在球磨机中粉碎。每个种子样 品测试重量为1. 5g。每种提取缓冲液（图11)以2:1缓冲液/样品比例（3mL)测试。将样 品涡旋2分钟，然后旋转2分钟，并收集上清。
[0167] 将在8M尿素或PBS-T中提取的样品使用PierceZeba旋转滤器缓冲液交换至 25mM碳酸氢铵。对于所有样品，将50μL组织提取物用110μL总体积的碳酸氢铵中的 l〇yg胰蛋白酶（去除）进行胰蛋白酶消化。蛋白质消化在37°C进行16小时，然后冷却至 4°C。作为对于四种待多重检测的蛋白质的每一个的阳性对照，使用纯化的蛋白质标样制备 含大约50μg/mL每种单独完整蛋白质的混合液（cocktailmix)。将混合液的最终1:10稀 释掺入空白叶提取物样品和空白种子提取物样品至基质阳性对照浓度为大约5μg/mL。这 些补强的空白充当阳性对照，当与空白组织对照（阴性对照）和5XH751XT玉米组织提取物 相比时，得到准确的肽LC保留时间和MS/MS序列碎片数据。因为所有四种待在5XH751XT 中多重检测的蛋白质为同样用于开发上述多重-6LC/MS/MS方法的蛋白质，无需进一步的 开发以确定要检测何种蛋白质特异性肽/碎片离子以及在何种装置条件下进行。
[0168] 将上述的多重-6方法用于分析5XH751XT叶和种子组织提取物。图7-10为使用 多重-4LC-MS/MS单次注入分析以检测在近交玉米叶和种子组织中表达的CrylF、Cry34、 Cry35和PAT蛋白质而采集的部分数据。
[0169] 具体而言，图7显示表达于近交玉米组织中的CrylF的LC-MS/MS多重检测。该数 据为对于用25mM碳酸氢铵提取的5XH751玉米叶组织中多重鉴定出的CrylF具特异性的 MS/MS谱。检测出了三种CrylFT22特异性碎片离子，本文中仅显示了一种碎片。还显示了 MS/MS转换的阳性和阴性对照。
[0170] 图8显示了表达于近交玉米组织的Cry34的LC-MS/MS多重检测。该数据为对于 用25mM碳酸氢铵提取的5XH751玉米叶组织中多重鉴定出的Cry34具特异性的MS/MS谱。 还显示了MS/MS转换的阳性和阴性对照。检测出了五种Cry34T7特异性碎片离子，本文中 仅显示一种。5XH751XT样品和Cry34补强的阳性对照之间保留时间的微小变化对于在反 相梯度的早期、更加亲水性区域洗脱的蛋白质而言并非意料之外。在空白叶对照小图中显 示的峰如由来自柱的保留时间的巨大（~7分钟）移动所确定，为非特异性峰。其他四种 Cry34碎片离子均无非特异性峰。
[0171] 图9显示了表达于近交玉米组织中的Cry35的LC-MS/MS多重检测。该数据为对 于在玉米叶组织中多重鉴定出的Cry35具特异性的MS/MS谱。还显示了MS/MS转换的阳 性和阴性对照。显示的数据来自用25mM碳酸氢铵提取的5XH751叶组织。检测出了三种 Cry35T9特异性碎片离子，本文中仅显示一种。
[0172] 图10显示了表达于近交玉米组织的PAT的LC-MS/MS多重检测。该数据为对于在 玉米叶组织中多重鉴定出的PAT具特异性的MS/MS谱。还显示了MS/MS转换的阳性和阴性 对照。
[0173] 对于每种蛋白质，检测并碎片化特异性前体肽，其中检测三至五种相应的碎片离 子以确保蛋白质序列确证。图7、8、9和10分别显示了对玉米组织中多重鉴定的四种蛋白 质中的一种具特异性的MS/MS谱。每个图还显示了对于具体MS/MS转换的适当阳性和阴性 对照。四种蛋白质中的两种在种子组织中检测出。无法检测出四种蛋白质中的两种可能是 由于低表达，因为历史数据表明这四种蛋白质在种子中与叶组织相比表达较低。
[0174] 实施例V
[0175] 通过在转基因植物品种的下一世代中确证两种目标蛋白质的存在来维持该转基 因植物品种。选择了转基因植物，其中所述转基因植物包含两种目标转基因蛋白质（A和 B)。制备了蛋白质A和B的样品，并对其进行LC/MS/MS分析。根据所得的MS谱，选择母蛋 白质的碎片肽离子以供靶向MS/MS分析。
[0176] 从转基因植物的第一世代制备了复杂蛋白质样品，并对所述复杂蛋白质样品进行 多重LC/MS/MS分析，其中通过在MS谱中确定选定的碎片肽离子的存在来鉴定蛋白质A和 B的选定的碎片肽离子。然后从转基因植物的下一世代的植物制备复杂蛋白质样品。对这 些下一世代植物的复杂蛋白质样品进行多重LC/MS/MS分析。繁殖下述下一世代的植物以 维持转基因植物品种：从这些植物制备的复杂蛋白质样品产生其中根据选定碎片肽离子的 存在鉴定出了蛋白质A和B均存在的MS谱。为了维持转基因植物品种，不繁殖下述下一世 代的植物：从这些植物制备的复杂蛋白质样品产生其中蛋白质A或蛋白质B的存在均未鉴 定出的MS谱。
[0177] 实施例VI
[0178] 筛选从植物转化方法中获得的转化体以确定两种目标靶蛋白的存在。对两种靶蛋 白（A和B)进行LC/MS/MS分析。根据所得的MS谱，选择母靶蛋白的碎片肽离子以供靶向 MS/MS分析。
[0179] 从植物转化方法获得推定的转化体。从每个推定的转化体制备复杂蛋白质样品。 将这些推定的转化体的复杂蛋白质样品进行多重LC/MS/MS分析，其中靶蛋白的表达是通 过明确选定碎片肽离子的存在来确定的。繁殖下述转化体，从这些转化体制备的复杂蛋白 质样品产生其中根据选定的碎片肽离子的存在确定了蛋白质A和B所需的表达特征的MS 谱。
[0180] 实施例VII
[0181] 实现了转基因在转基因植物中的生物限制。对两种由转基因植物表达的靶蛋白（A 和B)进行LC/MS/MS分析。根据所得的MS谱，选择母靶蛋白的碎片肽离子以供靶向MS/MS 分析。
[0182] 收集来自在转基因植物周围环境中生长的植物的植物材料。从该植物材料制备了 复杂蛋白质样品。对来自这些植物材料的复杂蛋白质样品进行多重LC/MS/MS分析，其中污 染转基因的存在是通过明确所表达转基因蛋白质的选定碎片肽离子的存在来确定的。摧毁 下述植物：从这些植物收集的材料通过多重LC/MS/MS分析显示包含污染的转基因蛋白质。
[0183] 通过提述将以下文件以其整体并入本文：
[0184] Alwine等（1977)Proc.Nat.Acad.Sci. 74:5350-54Baldwin(2004)M〇1.Cell. Proteomics3(1) : 1-9 ;Carr和Annan(1997)Overviewofpeptideandproteinanalysis bymassspectrometry.In:CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编车耸 NewYork:Wiley,ρ· 10. 21. 1-10. 21.27;Chang等（2000)PlantPhysiol. 122 (2): 295-317; Domon和Aebersold(2006)Science312(5771):212-17;Nain等（2005)PlantMol.Biol. Rep. 23:59-65 ；Patterson(1998)Proteinidentificationandcharacterizationby mass spectrometry. In:Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等编辑New York:ffiley, p. 10. 22. 1-10. 22. 24 ；Paterson and Aebersold(1995)Electrophoresis 16:1791-1814 ;Rajagopal和Ahern(2001)Science 294 (5551):2571-73 ;Sesikeran和 Vasanthi (2008)Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17Suppl. 1:241-44;以及Toplak等（2004)Plant Mol. Biol. Rep. 22:237-50〇
【主权项】
1. 一种在来自转基因植物的基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知氨基酸序 列的目标蛋白质的存在的高通量方法，该方法包括： (i) 对于两种或更多种蛋白质提供质谱数据，所述两种或更多种目标蛋白质为该转基 因植物中转基因表达的预期产物； (ii) 提供包含蛋白质的复杂的基于植物的样品的第一注入，其中所述样品是从目标组 织提取的粗植物基质； (iii) 使所述粗植物基质与蛋白酶接触以将蛋白质消化成肽； (iv) 将经消化的粗植物基质注入液相层析-质谱装置； (V)对于所述肽获得同时质谱数据，和 (vi)将V)的同时质谱数据与所述对于所述两种或更多种目标蛋白质提供的质谱数据 相比较，由此确定所述两种或更多种目标蛋白质的存在与否。2. 权利要求1的方法，其中所述两种或更多种目标蛋白质为两种目标蛋白质或四种目 标蛋白质。3. 权利要求1或2的方法，其中所述蛋白质是在注入之前的单一步骤中消化的。4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述蛋白质是在单一步骤中电离的。5. 权利要求1-3中任一项的方法，其中对于对应于两种或更多种目标蛋白质的肽的质 谱数据是在单一步骤中获得的。
【专利摘要】本发明涉及层叠的转基因蛋白质的多重分析。具体地，本发明涉及供使用质谱法多重分析来自植物的复杂蛋白质样品的方法。在一些实施方案中，本公开涉及供维持转基因植物品种的方法，例如通过就多重的转基因蛋白质的存在和浓度来分析转基因植物品种的世代。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105241972
【申请号】CN201510591882
【发明人】J·劳里, J·弗卢克
【申请人】陶氏益农公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2010年6月3日
【公告号】CA2763896A1, CN102458617A, CN102458617B, EP2437869A2, EP2437869A4, EP2437869B1, US8227252, US20100313290, WO2010141674A2, WO2010141674A3